一种人源性可溶型CD74蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于免疫学和生物技术领域，本发明专利技术提供了一种人源性可溶型CD74蛋白的ELISA检测试剂盒，及其检测方法。本发明专利技术的试剂盒可准确检测人体液或细胞上清中的人源性可溶型CD74蛋白的含量，结果由酶标仪定量分析，排除了免疫组化、免疫荧光、Western?blot等半定量方法的主观性；而且灵敏度高，检测到的CD74蛋白最低可至800pg/ml；本发明专利技术检测时不需要复杂仪器，易于在科研院校和医疗机构中推广应用，可大规模检测临床标本，快速获得人CD74蛋白相关的海量数据和信息。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学和生物
，具体涉及一种人源性可溶型CD74蛋白的ELISA检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
0)74即主要组织相容性复合物II类分子相关恒定链(major histocompatibilitycomplex, MHC-11-associated invariant chain, Ii ),又称为 HLA-DR γ，在人类其基因定位于5号染色体长臂3区I带至3区3带(5q31_q33)，包含9个外显子。⑶74主要在树突状细胞、单核巨噬细胞、B细胞、朗罕氏细胞等抗原递呈细胞中表达。作为MHC-1I类分子伴侣，⑶74的主要功能与抗原递呈有关；作为II型膜蛋白，还有2-5%的⑶74在细胞膜上表达，其功能和MHC-1I类分子无关。近来研究发现⑶74是巨噬细胞移动抑制因子(MacrophageMigration Inhibitory Factor, MIF)的受体，与 MIF 结合可激活 NF-κ B、ERKl/2 等信号转导途径，进而诱导炎性细胞因子的分泌；研究还发现，⑶74除了表达于抗原递呈细胞，与抗原递呈有关外，CD74蛋白还在内皮细胞、肿瘤细胞表达，与相应疾病的发生、发展相关。已有研究证实CD74参与了某些炎症性疾病或自身免疫性疾病的发病过程。与健康人群相比，动脉粥样硬化病人的斑块和外周血单核细胞中的CD74表达增高。具有动脉硬化斑块形成倾向的Ldlr基因敲除小鼠，如同时缺失CD74基因，则动脉粥样硬化的程度减轻。可自发形成糖尿病的NOD小鼠，如果敲除CD74基因，则血糖水平降低。就系统性红斑狼疮而目，两种具有狼疮倾向的小鼠品系，其循环血液中MIF水平的升闻与疾病的发展和肾小球性血管炎的形成具有密切的时间依赖关系。同时，肾脏MIF，⑶74，和⑶44 (⑶74的协同分子)mRNA和蛋白的表达也随着炎症的发展显著升高。最近研究发现来源于系统性红斑狼疮小鼠的B细胞， 其MIF和⑶74的表达均明显增高，如激活这类B细胞的MIF/⑶74通路，则可延长系统性红斑狼疮小鼠的存活时间。慢性炎症的病程后期组织发生恶变可形成肿瘤。幽门螺杆菌(He I i cobaterpylori，HP)感染时，胃上皮的⑶74表达明显增加。HP的尿素酶可直接与胃上皮的⑶74蛋白结合，结合的同时促进CD74基因和蛋白的表达。细胞表面累积的CD74导致了胃上皮的持续炎症。⑶74的配体MIF在HP感染时也显著增高。MIF通过结合⑶74激活胞内信号途径NF- K B和ERK1/2，促进炎性细胞因子的产生，加快细胞增殖和延长细胞存活。由HP引发的长期炎症刺激可演变成为慢性胃炎，形成胃溃疡，并最终引发胃的恶性病变。⑶74不仅是MHC-1I类分子伴侣，并参与炎症和自身免疫性疾病的发病过程，而且近年多篇文献报道⑶74和多种肿瘤的发生发展相关。如Ishinami等研究发现，⑶74表达阴性的胃癌患者术后预后优于⑶74表达阳性的患者；Nagata等发现⑶74可作为预测胰腺癌的生物分子标志物。此外，CD74及其配体MIF在多种肿瘤中高表达，如肺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、膀胱癌、肾癌。在慢性淋巴细胞白血病中，MIF/⑶74通过NF-K B途径促进B细胞分泌IL-8，分泌的IL-8进一步诱导了抗凋亡蛋白Bcl-2的转录和翻译，从而促进了 B细胞的存活。此外，MIF/⑶74还能通过上调TAp63直接调控Bcl_2蛋白，从而影响B细胞的存活。Hertlein等发现在慢性淋巴细胞白血病患者中，疗效甚好的⑶74单克隆抗体MiIatuzumab并不像其他单抗那样通过特异性结合细胞膜蛋白，发生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀死靶细胞，而是通过上调靶细胞膜表面CD74的表达引起细胞凋亡达到治疗目的。上述研究表明⑶74在炎症和肿瘤中发挥了重要的作用，可能成为这些疾病的生物标记物，亦可能成为相关疾病的疗效判定和预后指标。以往对⑶74表达的研究主要是采用免疫组化、免疫荧光、Western blot以及RT-PCR等半定量的方法。通过资料检索，国内外尚无任何关于定量检测人源性CD74蛋白的报道，且目前仍无法确定CD74蛋白是否存在可溶型形式。最新研究发现⑶74是参与调控性内膜蛋白水解(Regulated IntramembraneProteolysis, RIP)过程的家族一员。作为II型跨膜蛋白，在受外界刺激或应激状态下，⑶74的胞外段首先在蛋白酶的作用下被剪切后与细胞膜分离，同时暴露内膜蛋白酶结合位点；随后在内膜蛋白酶的水解下，CD74的胞内段与细胞膜分离，并转移至细胞核作为转录因子启动相关基因的转录。这个在内膜蛋白酶作用下发生的跨膜蛋白胞内段的信号传递过程称为RIP。⑶74的RIP过程已在B细胞的成熟和分化中被证实。参与RIP过程的⑶74蛋白，其胞外段必须先与细胞膜分离暴露内膜蛋白酶结合位点才能继续完成RIP的过程。根据上述理论，与细胞膜分离的⑶74胞外段是否就是可溶型的⑶74 (soluble⑶74，s⑶74)呢？目前对于sCD74的研究国内外尚属空白。许多细胞因子的膜受体都存在可溶型形式。这些可溶型细胞因子受体以其多种方式在人体内发挥相应的生理和病理作用。以往研究证实部分可溶型膜分子在相关疾病的诊断、发病机制和治疗中发挥重要作用，例如sIL-lR，sIL-6R。鉴于s⑶74存在的可能性，以及CD74在炎症、自身免疫性疾病以及肿瘤等病人的组织细胞中异常高表达，因而有必要开发针对实验室或临床生物样本中sCD74的定量检测方法，从而有望将sCD74作为一种新的生物标记物，为疾病的诊断、病程判断、疗效观察、指导用药及预后提供一种辅助判定指标，也为进一步研究sCD74蛋白的功能奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人源性可溶型CD74蛋白的ELISA检测试剂盒，本专利技术的另一目的是提供利用上述试剂盒的检测方法。本专利技术旨在为检测临床和实验室样品中人源性可溶型CD74蛋白含量提供准确、简便、灵敏度高、并可被广泛使用的检测手段。本专利技术采用的技术方案如下:本专利技术利用ELISA技术建立了检测人源性可溶型CD74蛋白的试剂盒，并首次证实在某些病理状态下人的血清和细胞上清中存在可溶型⑶74。本专利技术第一方面，提供了一种人源性可溶型⑶74蛋白的ELISA检测试剂盒，主要包括:包被有人源性⑶74抗体的ELISA酶标板，所述的人源性⑶74抗体为羊抗人⑶74抗体C-16 ；检测人源性可溶型⑶74抗原的抗体，为小鼠抗人⑶74抗体LN-2 ；酶标二抗，HRP (辣根过氧化物酶)标记的马抗小鼠IgG ；标准蛋白，为重组人⑶74蛋白，R&D公司；所述的试剂盒，还包括有:常规的样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗脱液、抗体稀释液、显色液，和终止液。所述的试剂盒，ELISA酶标板为市售的ELISA酶标板，较优地，可选用丹麦NUNC公司的 Maxisorp 系列 ELISA 酶标板(96 孔，#44-2404)。包被缓冲液，较优的为1XPBS，pH: 7.4 ；封闭液，较优的为SuperBlock的封闭液；ELISA酶标板洗脱液，较优的为含0.05%Tween_20的I X PBS溶液样品稀释液:样品为血清时，较优的为1XPBS，pH:7.4 ;样品为细胞上清液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源性可溶型CD74蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：包被有人源性CD74抗体的ELISA酶标板，所述的人源性CD74抗体为羊抗人CD74抗体C?16；检测人源性可溶型CD74抗原的抗体，为小鼠抗人CD74抗体LN?2；酶标二抗，HRP（辣根过氧化物酶）标记的马抗小鼠IgG；标准蛋白，为重组人CD74蛋白，R&D公司。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：夏照帆，孙瑜，唐昊，韩姝，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：