红籽鸢尾的快速繁殖方法技术

本发明专利技术涉及红籽鸢尾的再生快速繁殖方法，属于生物技术育种领域。以红籽鸢尾茎尖为外植体，采用随机区组设计的方法筛选出最佳诱导培养基。外植体首先诱导出愈伤组织，继代培养后诱导不定芽，而后不定芽经壮苗后转入生根培养基中生根培养，获得完整植株。愈伤组织的最适诱导培养基为MS+2，4-D1.5mg·L-1+6-BA0.1mg·L-1，最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1，不添加激素的MS培养基中壮苗，能得到生长健壮的无根苗，培养基MS+NAA0.2mg·L-1的生根效果最优。本发明专利技术首次针对红籽鸢尾建立了其快速繁殖体系，为红籽鸢尾生物技术育种工作提供了理论基础和实验依据，将有效推动红籽鸢尾生物技术育种的进程。

Rapid propagation method of red seed iris

The invention relates to a method for regenerating and regenerating red iris, belonging to the field of biotechnology breeding. The optimum culture medium was selected by using the method of randomized block design, with the stem tip of red iris as explants. First of all explants to induce callus, the induction of adventitious buds cultured, then adventitious bud was then transferred to seedling culture medium for rooting rooting, complete plants were obtained. The most suitable callus induction medium was MS+2, 4-D1.5mg - L-1+6-BA0.1mg - L-1, the best adventitious bud induction medium was MS+6-BA1.0mg L-1+NAA0.2mg L-1, do not add hormone MS medium seedling, seedlings can obtain robust growth, the best rooting culture based MS+NAA0.2mg L-1. The invention for the first time established the red seed iris rapid propagation system, provide the theoretical and experimental basis for red seed breeding of iris, iris will effectively promote the red seed biotechnology breeding process.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为，属于生物技术育种领域。一
技术介绍
红籽鳶尾{Iris foetidissimaL.)是鳶尾科鳶尾属多年生草本植物,分布于西欧和非洲北部等地。株高30 40 cm,叶鞘状剑形深绿色，自然花期4-5月，每花茎3 5朵，花径7 10 Cm，花色有紫、黄等色，果期7-8月，果蒴大籽实饱满，成熟后即开裂露出红、橙黄、白等不同色泽光亮的种子十分夺目，且一直垂挂到第二年春天；另外，该物种还具有耐寒性好，在长江中下游地区四季常绿，较强的适应性、抗性以及粗放管理等，是一种难得的兼观花、观叶和观果的高观赏价值常绿地被植物。但红籽鸢尾的繁殖率较低，分株自然繁殖系数仅为5 8，虽然种子的结实率较高，但普遍存在由于种子休眠期限长而且不等造成发芽率低、出苗不整齐等不足，因此极大地限制了红籽鸢尾的推广应用。而器官离体培养却是解决红籽鸢尾快速繁殖的有效途径，也为红籽鸢尾今后的规模化工厂繁殖生产以及推广应用、基因工程乃至转基因育种奠定了良好的基础。二
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的是建立一套适用于红籽鸢尾的快速繁殖体系，专门对红籽鸢尾的快速繁殖进行了系统深入研究，为红籽鸢尾基因工程和转基因育种奠定基础。技术方案 本专利技术是一种建立红籽鸢尾快速繁殖的方法，其实施方案如下: a、外植体的处理 选择红籽鸢尾茎尖Icm的材料，将得到的材料于体积比10%的洗涤剂中浸泡10-15min，流水冲洗lh，然后置于超净工作台中，依次用体积比75%乙醇浸泡45s，无菌水冲洗3次，质量体积比0.1%的升萊消毒10-12min,无菌水浸泡冲洗4次； b、培养条件 培养室温度:25±2°C ;湿度:50 70% ;光照强度为200(Γ30001χ ;光周期:12h/d ； C、快速繁殖体系 O愈伤组织诱导 取a步骤中处理好的材料放置于培养皿的无菌滤纸上，吸去水分，然后将近茎尖2mm区域的组织切成 2mmX 2mmX 2mm 大小，接种于 MS+2,4-D 1.5mg.L ^Θ-ΒΑΟ.1mg.L1, 30d 后将带有愈伤的外植体继代到相同的培养基上，愈伤组织继续膨大，并陆续观察到淡绿色愈伤组织出现，愈伤组织的最佳继代周期是4-5周；培养基蔗糖含量为质量比3%，琼脂为质量比0.6%, pH 为 5.8 ; 2)不定芽诱导 将继代2-3次的愈伤组织接种到MS+6-BA1.0mg.Γ'+ΝΑΑΟ.2mg.Γ1培养基中30d，培养基蔗糖含量为3%，琼脂为0.6%，pH为5.8 ; 3)壮苗将继代2-3次的芽丛转接到不添加激素的MS培养基中壮苗； 4)不定芽生根诱导 不定芽经壮苗后，转接于MS+NAA 0.2mg.Γ1培养基中生根。有益效果 本专利技术提供的一种建立红籽鸢尾快速繁殖的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果； 1、本专利技术首次针对红籽鸢尾的快速繁殖进行了系统深入的研究，为后续的红籽鸢尾的开发利用和转基因育种工作提供了最基本的方法。2、在快速繁殖方法中，利用两种激素(生长素2，4_D、细胞分裂素6-BA )随机区组设计筛选出最佳诱导愈伤组织培养基(MS+2，4-D 1.5mg.Γ'+Θ-ΒΑΟ.1mg.L-1);利用两种激素(细胞分裂素6-BA、生长素NAA)随机区组设计筛选出最佳不定芽诱导培养基(MS+6-BA1.0mg.L_1+NAA0.2mg.Γ1)、壮苗培养基(MS);生根培养基以 MS+NAA0.2mg.Γ1 生根效果最优，且生根率达到100%。四附图说明 图1红籽鸢尾诱导愈伤组织图 A:14d;B:21d;C:继代 30d 图2红籽鸢尾愈伤组织诱导不定芽的过程 A:7d;Bl-B2:21d;C:35d;D:42d;E:壮苗 21d 图3红籽鸢尾不定芽的生根图 A:14d;B-C:30d 五具体实施例方式 本专利技术提供的一种建立红籽鸢尾快速繁殖体系的方法，其具体实施方式如下: I红籽鸢尾快速繁殖的方法 1.1外植体的处理 以从法国引进的红籽鳶尾(Zri1S foetidissimaL.)(江苏省中国科学院植物研究所鳶尾种质资源圃中对外公开提供)的茎尖为材料，经清水冲洗，去掉根和叶，注意保留距茎尖约Icm的材料。将得到的材料于体积比10%的洗涤剂(洗碗用的白猫洗洁净)中浸泡并搅拌10-15min,流水冲洗干净,滤纸吸干水分,在超净工作台上用75%乙醇浸泡45s,无菌水浸泡冲洗3次，再用0.1%升汞消毒10-12min，无菌水冲洗4次后，将材料放置于培养皿的无菌滤纸上，吸去水分，然后将近茎尖约2mm区域的组织切成2mmX 2mmX 2mm的小块作为外植体块。1.2快速繁殖体系 1.2.1最佳诱导愈伤组织培养基的筛选 愈伤组织诱导培养，将切好的外植体块接种于含有生长素2，4-D分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg.Γ1和细胞分裂素6-BA分别为0.1,0.2,0.3mg.Γ1的MS培养基中，每瓶接种6个外植体，每个处理5瓶，在相同的培养条件下重复3次，观察并记录不同培养基上愈伤组织的诱导情况；30d后统计愈伤组织诱导率，培养基蔗糖含量为3%，琼脂0.6%，pH5.8。 愈伤组织诱导率(％)=愈伤组织诱导总数/接种外植体总数X 100% 最终得到最佳诱导愈伤组织的培养基是MS+2，4-D 1.5mg.Γ'+Θ-ΒΑΟ.1mg. Λ3(Μ后将带有愈伤的外植体继代到相同的培养基上，愈伤组织继续膨大，并陆续观察到淡绿色愈伤组织出现，愈伤组织的最佳继代周期是4-5周。1.2.2不定芽诱导 将继代2-3次的愈伤组织接种到含有细胞分裂素6-BA分别为0.5、1.0、1.5,2.0mg -Γ1和生长素NAA分别为0.2、0.3、0.5mg.Γ1的MS培养基中，每瓶接种6个，每个处理5瓶，在相同培养条件下重复3次，观察并记录不同培养基上不定芽的诱导情况；30d后统计不定芽诱导率，培养基中蔗糖、琼脂含量和PH同上。不定芽诱导率(％)=不定芽诱导总数/接种愈伤组织块总数X 100% 7d后淡绿色愈伤组织开始变成深绿色，并有芽点突起，21d后有不定芽产生，并发现随着细胞分裂素6-BA浓 度的提高，不定芽的再生率也逐渐增加，但不定芽长势却呈下降趋势，由于不定芽多，不定芽较细弱，生长素NAA在0.2-0.5mg.Γ1的浓度范围内对不定芽再生影响不显著。最终确定MS+6-BA1.0mg.L_1+NAA0.2mg.L—1的诱导效果最好。1.2.3 壮苗 将继代2-3次的不定芽丛转接到含有细胞分裂素6-BA为0、0.5mg.Γ1和生长素NAA为0、0.2mg *L_1的MS培养基中，每瓶接种6个芽丛，每个处理5瓶，在相同的培养条件下重复3次，观察并记录芽丛的生长情况。结果表明，不定芽转接到不添加激素的MS培养基中壮苗，能得到生长健壮的无根苗。1.2.4不定芽生根情况 不定芽经壮苗后，转接于含生长素NAA分别为0、0.2,0.5、1.0mg -Γ1的MS和1/2MS培养基中，每瓶接种6个不定芽，每个处理5瓶，在相同的培养条件下重复3次，观察并记录生根情况。30d后统计生根率。生根率(％)=不定芽生根株数/接种不定芽数X 100% 比较发现，MS+NAA 0.2mg.Γ1培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
红籽鸢尾的再生快速繁殖方法，包括：a、外植体的处理????选择红籽鸢尾茎尖1cm的材料，将得到的材料于体积比10%的洗涤剂中浸泡10?15min，流水冲洗1h，然后置于超净工作台中，依次用体积比75%乙醇浸泡45s，无菌水冲洗3次，质量体积比0.1%的升汞消毒10?12min,无菌水浸泡冲洗4次；b、培养条件??????????培养室温度：25±2℃；湿度：50~70%；光照强度为2000~3000lx；光周期：12h/d；?c、快速繁殖体系1）愈伤组织诱导????取a步骤中处理好的材料放置于培养皿的无菌滤纸上，吸去水分，然后将近茎尖2mm区域的组织切成2mm×2mm×2mm大小，接种于MS+2，4?D?1.5mg·L?1+6?BA0.1mg·L?1，30d后将带有愈伤的外植体继代到相同的培养基上，愈伤组织继续膨大，并陆续观察到淡绿色愈伤组织出现，愈伤组织的继代周期是4?5周；培养基蔗糖含量为质量比3%，琼脂为质量比0.6%，pH为5.8；2）不定芽诱导????将继代2?3次的愈伤组织接种到MS+6?BA1.0mg·L?1+NAA0.2mg·L?1培养基中30d，培养基蔗糖含量为质量比3%，琼脂为质量比0.6%，pH为5.8；3）壮苗????将继代2?3次的芽丛转接到不添加激素的MS培养基中壮苗；4）不定芽生根诱导????????????不定芽经壮苗后，转接于MS+NAA?0.2mg·L?1培养基中30d生根。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄苏珍，张永侠，原海燕，顾春笋，佟海英，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：