本发明专利技术提供一种以滤纸条为操作载体的植物微茎尖小液滴包埋玻璃化超低温保存、解冻及恢复培养方法，包含步骤有：在解剖镜下剥取无菌苗茎尖，浸入2%~5％无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，将茎尖排列在无菌滤纸条上，将其浸入0.1%氯化钙溶液中，经10~20min固定，再将带有茎尖的滤纸条放入0.3~0.5mol·L-1蔗糖的MS液体中培养1~3天，置于预处理溶液中处理20-40min转入玻璃化保护剂中处理10~80min，然后将带有茎尖的滤纸条转移到无菌冷冻管中放入液氮中保存。解冻时，将带有茎尖的滤纸条由管中取出放入含1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20min将带茎尖的滤纸条放入恢复培养基进行培养，直至生长成植株，本发明专利技术方法以滤纸条为操作载体，减少接种器具与植物细嫩茎尖的直接接触，降低机械损伤。
Method for cryopreservation, thawing and recovery of plant micro tip
The invention relates to a filter paper as the carrier for the operation of plant microapical droplet encapsulation vitrification cryopreservation, thawing and cultivation method, comprising the steps of: under the anatomical microscope in stripping aseptic seedling shoot tip, immersed in 2%~5% calcium alginate solution with no light, will be arranged in the stem tip sterile filter paper strips, be immersed in 0.1% calcium chloride solution, fixed by 10~20min, then cultured for 1~3 days MS liquid with stem tip filter strips into 0.3~0.5mol L-1 sucrose, a pretreatment to 10~80min vitrification protective agent in 20-40min solution, and then with the shoot tip filter paper transfer the sterile tube frozen in liquid nitrogen preservation. When thawed, with stem tip filter strips by pipe out into the containing 1.2mol - L-1 sucrose MS medium thawing and washing 20min will take stem tip filter paper strip in the recovery medium, until the growth of plant, the method of the invention is to filter paper as carrier for the operation, reduce the inoculation appliances and delicate plants shoot tip of direct contact, reduce mechanical damage.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到一种种质资源保存和解冻培育的方法，具体的说，涉及到一种植物微茎尖小液滴包埋玻璃化超低温保存和解冻培养的方法，属植物细胞工程
技术介绍
种质资源的保存广义上有现地保存和异地保存两种。对于那些无法用种子进行长期保存的植物如营养繁殖植物及顽拗性种子植物来说:田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。而在超低温保存条件下，植物的生理生化活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内。被认为是这类植物目前安全、有效、经济的基因资源长期保存的最有希望的保存方法。大多数植物材料如悬浮细胞、愈伤组织、茎尖、芽尖、胚等，含有大量的细胞间水分，对冷冻伤害特别敏感。特别是植物分生组织、芽端的细胞质分布均匀而且稠密，对低温冰冻极为敏感，冰冻过程中的损伤效应特别突出，哪怕是局部的冰冻损伤都会影响冻后的正常分化与再生。同时，分生组织、芽端必须保持结构的完整性才能快速分化。在操作过程中，细嫩组织容易受到机械损伤，从而造成成活率下降。因此，超低温保存面临的课题是尽可能采取更多的、更有效的手段来保证分生组织、芽端在超低温保存过程中免受损伤。在20世纪的90年代后，以PVS2作为冷冻保存液的玻璃化法成为植物超低温保存的主要方法(参见 Sakai A, Engelmann F.Vitrification, encapsulation-vitrificationand droplet-vitrification:a review.Cryoletters, 2007, 28 (3): 151-172.) 植物材料经高浓度的保护液中处理后，迅速投入液氮中，水分形成玻璃化状态，从而避免形成冰晶造成机械损伤，有效保护植物组织，被成功运用于100多种植物不同组织的超低温保存。随着玻璃化方法的发 展，保存技术的进一步多样化与简易化，近年来在传统玻璃化法上发展出来的包埋玻璃化法(参见D.Hira, A Sakai, Simplified cryopreservationof sweet potato by optimizing conditions forosmoprotection, Plant Cell Reports, (2003) 21:961-966),即将植物组织在海藻酸酸中形成包埋小珠，再经玻璃化法处理后进行冷冻的方法，综合了传统玻璃化法与包埋脱水法的优点，操作较简便且减少玻璃化过程中对茎尖的机械损伤，成功应用于苹果、薄荷、草莓、柿、山药、大蒜等植物的超低温保存。最新发展的小液滴法(参见Halmagyi A, Delie C，IsacV.Cryopreservation of Malus cultivars:Comparison of two droplet protocols.Scientia Horticulturae, 2010, 124(3):387-392.)，将植物材料经玻璃化处理后，在铝箔上滴成小液滴，后直接投入液氮进行迅速冷冻。由于冻存及解冻速度快，组织不易形成冰晶，易成活再生，是一有发展前景的方法。超低温保存中，茎尖大小及结构的完整性对超低温保存的成活率及恢复培养均有影响。材料体积小，在冻存中容易脱水，受冰晶伤害小，但对操作水平要求较高，容易造成机械损伤，在其后的恢复生长中不易成活。故在超低温保存过程中，应尽量减少对茎尖的操作损伤以及冻存过程中冰晶对组织造成的损伤，从而达到较高的成活率。现有技术在超低温保存过程中，需对细嫩茎尖进行数次操作，对技术人员要求较高且易造成茎尖二次机械损伤。
技术实现思路
本专利技术中针对现有技术的不足，采用滤纸小条作为操作载体，批量处理茎尖以提高操作效率，减少接种器具与植物细嫩茎尖的直接接触，从而减少机械损伤，提供一种适用于植物微茎尖小液滴包埋玻璃化超低温保存方法及冷冻植株后再生的技术。为了实现上述的技术目的，本专利技术采用的技术方案是提供一种植物微茎尖超低温保存和解冻、恢复培养方法，其保存方法包括如下步骤:在解剖镜下剥取无菌苗茎尖，浸A 2% 5%无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸后，将茎尖排列在无菌滤纸条上，然后将其浸入0.1%氯化钙溶液中，经10 20min固定后，再将带有茎尖的滤纸条放入0.3 0.5mol -L-1蔗糖的MS液体中培养I 3天， 置于预处理溶液中处理20-40min转入玻璃化保护剂中处理10 80min，然后将带有茎尖的滤纸条转移到无菌冷冻管中放入液氮中保存。本专利技术一种优选的实施方案是，所述经10 20min固定是指将含有茎尖的滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中进行包埋固化。本专利技术一种优选的实施方案是，所述无菌滤纸小条为3mm x20mm的无菌滤纸小条。本专利技术一种优选的实施方案是，所述预处理溶液为包含l-3mol.171甘油和0.2-0.6mol L—1蔗糖的MS液体培养基，优选的预处理溶液为含2mol L—1甘油和0.4mol L—1蔗糖的MS液体培养基。本专利技术一种优选的实施方案是，所述玻璃化保护剂包含1.63-4.89mol L—1甘油、1.61-4.84mol I71 乙二醇、1.27-3.8ImoI L-1DMSO 和 0.3-0.5mol I71 蔗糖，优选的玻璃化保护剂包含 3.26mol I71 甘油、2.42mol I71 乙二醇、1.9mol [1DMSO 和 0.4mol I71 蔗糖。本专利技术还提供一种植物微茎尖超低温解冻、恢复培养的方法，其包括以下步骤:将权利要求1 5保存的带有茎尖的滤纸小条由冷冻管中取出，然后放入含1.2mol -r1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20min，将解冻及洗涤后的茎尖放入恢复培养基进行暗光或弱光培养3天后转入到常光培养，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，茎尖可直接长成植株。本专利技术一种优选的实施方案是，，所述恢复培养基为MS半固体培养基，所述MS半固体培养基包含 0.5mg L 1BAa0.1mg L 1NAA 和 0.5mg L 1GAS0在本专利技术中，若无特别指出，本专利技术中所涉及的溶液均为水溶液；本专利技术中涉及到的预冷的温度是指4°C。本专利技术的技术效果是，采用的保存和解冻培育方法操作简便，稳定可靠，减少了在各项操作过程中对茎尖的机械损伤，保存后恢复生长状况良好，植株再生率高的可达60%以上，取得了良好的经济和社会效果。附图说明图1是本专利技术的操作流程图。(a、拣选优良的植物外植体；b、将获取的外植体经组织培养形成无菌组培苗；c、剥取无菌苗茎尖，浸入2% 5%的无钙离子的海藻酸钠溶液中轻蘸，用镊子将茎尖排列在3mmX20mm无菌滤纸小条上；d、将含有茎尖的无菌滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中，经10 20分钟固定；e、将固定后带有茎尖的滤纸小条放入0.3 0.5mol L-1蔗糖的MS液体或固体培养基中，培养I 3天；f、将茎尖置于预处理溶液中在室温下处理20-40分钟；g、将茎尖转入玻璃化保护剂中在4°C或室温下处理10 80分钟；h、将带有茎尖的滤纸小条转移无菌冷冻管中、将冷冻管直接投入到液氮中保存；j、将带有茎尖的滤纸小条由冷冻管中取出后放入选含1.2m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物微茎尖超低温保存和解冻、恢复培养的方法，其特征在于，所述保存方法包含的步骤有：在解剖镜下剥取无菌苗茎尖，浸入2%~5％无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸后，将茎尖排列在无菌滤纸条上，然后将其浸入0.1%氯化钙溶液中，经10~20min固定后，再将带有茎尖的滤纸条放入0.3~0.5mol·L?1蔗糖的MS液体中培养1~3天，置于预处理溶液中处理20?40min转入玻璃化保护剂中处理10~80min，然后将带有茎尖的滤纸条转移到无菌冷冻管中放入液氮中保存。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林田，杨华，龙萍，朱天生，刘灶长，李天菲，罗利军，
申请(专利权)人：上海市农业生物基因中心，
类型：发明
国别省市：
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