一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用技术

一种豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，属于食品添加剂技术领域。本发明专利技术涉及以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH即抗氧化多肽粗品。该粗品PPH经SephadexG-25凝胶层析和两次RESOURCETM3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，浓度在0.2mg/mL时对DPPH自由基清除率达62.03%，与同浓度下谷胱甘肽对DPPH的清除率相近。反相高效液相(RP-HPLC)分析型色谱测定其纯度，超高效液相色谱-质谱法(Q-TOF-MS)分析鉴定其氨基酸序列。经脱盐后的PPH以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力。

【技术实现步骤摘要】

一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，属于生物制品分离纯化、食品添加剂

技术介绍
对植物蛋白的开发利用，可从营养和功能特性两方面综合考虑，营养特性是基础，功能特性决定着蛋白质资源的真正利用价值。通过对植物蛋白进行加工开发其功能特性，是提高蛋白质价值的一种有效手段。利用酶解技术加工植物蛋白生产生物活性肽，可应用于食品、医药、保健品及化妆品等领域中。豌豆作为一种传统的豆类作物，在我国拥有相当丰富的资源，存在着极大的开发潜能。国内目前对于豌豆的综合利用和深加工仍处于起步阶段，豌豆主要被许多厂家作为制作粉丝的原料，其主要是利用豌豆中的富淀粉含量来加工成粉丝，而剩下的膳食纤维和蛋白质等常用作饲料，这降低了豌豆的利用价值，因此需要提高豌豆功能特性方面的开发。豌豆蛋白的酶解产物中存在的生物活性肽，因其对人体具有多方面有益的生理功能，具有在食品加工、保健食品、医药等领域的开发潜力，可提高豌豆的利用率与使用价值，扩大豌豆的应用前景。抗氧化剂是维持食品原有质量和人体抗氧化防御系统动态平衡的物质基础，因此获取抗氧化剂显得非常重要。化学合成和自然存在的物质都具有抗氧化能力，化学抗氧化剂一般具有较高的有效性和很好的经济效益，然而安全性得不到保证，具有一定的毒性，只能在一定范围内使用。来自食物中的天然抗氧化剂虽然一般不及人工合成的高效，可是天然抗氧化剂没有剂量的限制，当达到一定浓度时可与化学抗氧剂等效，天然抗氧化剂安全无毒，对人体不存在副作用，现在已成为研`究开发的热点，越来越多的人们倾向于选择天然抗氧化剂。存在于蛋白质中的一些多肽具有抗氧化能力，自从第一次报告提出以来，越来越多的国内外学者对其进行广泛的研究。抗氧化肽安全高效，容易被人体吸收、分子量小、结构简单，在不同环境下保持稳定，不存在免疫排斥反应，除抗氧化性外还可作为机体的营养物质。因此，可以确信在食品、医药、人类健康等领域，采用酶法制备抗氧化肽是开发天然、安全、营养的抗氧化剂的一个重要方向。
技术实现思路
本专利技术目的是一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到抗氧化多肽粗品即豌豆蛋白水解产物PPH。PPH经凝胶层析和反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，液质联用分析推测其氨基酸序列。对PPH进行放大制备工艺与应用探究，选用超滤膜除大分子物质，纳滤膜进行脱盐浓缩处理，以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力，初步探明该豌豆抗氧化肽在功能型化妆品中的应用潜力。本专利技术的技术方案:一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH即抗氧化肽粗品。该粗品PPH经S印hadex G-25凝胶层析和两次RESOURCE 3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，步骤为: A豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽 (O原料预处理:以豌豆分离蛋白为原料，配置质量浓度为7.5%的豌豆分离蛋白水溶液，90°C水浴15 min进行预处理，冷却备用； (2)胰蛋白酶酶解:随后放在恒温磁力搅拌器上，溶液边搅拌边调至温度40°C、pH10，按照酶底比E/S为6%加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶活为4 X IO4 U/g,开始水解反应，随时滴加2M NaOH溶液保持酶解液pH 10不变，充分酶解反应4 h后，煮沸15 min灭酶； (3)中性蛋白酶酶解:步骤(2)产物冷却后按50°C、pH7.5,E/S为6%加入中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活为IXlO5 U/g，水解4 h，煮沸灭酶，冷却后用2 M HCl溶液调pH 7 ； (4)离心:步骤(3)产物按照8000r/min离心15 min去沉淀，所得上清液为豌豆蛋白水解产物PPH,即抗氧化肽粗品； B酶解豌豆抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法 (5)对PPH冻干样选用SephadexG-25进行分离,规格为1.6 cmX60 cm,配置浓度50mg/mL，加样量为2 mL，以纯水为洗脱剂，流速为1.5 mL/min，在280 nm处检测吸光度，在相同浓度下检测各峰 DPPH自由基的清除能力；收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥； (6)选出抗氧化性高的一组分在AKTA蛋白质分析纯化仪上进行反相色谱纯化，样品溶解于含有0.05% (v/v)三氟乙酸TFA的水溶液中，选用RESOURCE 3RPC色谱柱，进样量为I mL，以2 mL/min的流速用含5%乙腈和0.05%TFA的水溶液A进行洗脱，检测波长为215nm,使用自动收集器收集洗脱峰；5 min后，以流速为3 mL/min进行梯度洗脱,20 min时达到100%溶液B，溶液B为含60%乙腈和0.05%TFA的水溶液，每管5 mL进行收集；富集的样品进行旋转蒸发、冷冻干燥后测各组分的DPPH清除能力； (7)选出DPPH清除率高的组分再一次进行反相层析，溶液C为:含10%乙腈和0.05%TFA的水溶液；溶液D为:含50%乙腈和0.05%TFA的水溶液；其他条件保持不变；按峰收集样品，旋转蒸发、冷冻干燥成粉末，检测各峰的DPPH清除能力，选出活性最高的峰进行冷冻干燥；当浓度在0.2 mg /mL时，对DPPH的清除率达到62.03%，接近于同浓度下生物体内存在的抗氧化肽GSH对DPPH的清除能力66.42%，有很强的抗氧化性。(8)利用RP-HPLC分析型色谱测定纯化后的豌豆抗氧化肽样品，在9.436 min时出现一个比较纯的洗脱峰，纯度达到90.12% ;经液质联用分析推测出相对分子量为956.5Da,氛基酸序列为 Phe-Glu-Gly-Met-Thr-Phe-Leu-Leu。结果如图 2。用所述方法制备的抗氧化肽的应用，对所得PPH选用超滤膜除大分子物质，纳滤膜对PPH粗品进行脱盐浓缩处理，脱盐率达到79.87%，PPH浓缩2.86倍，纳滤过后蛋白损失率为12.15% ;随后以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力。(I)纳滤脱盐:豌豆蛋白双酶酶解生成豌豆蛋白水解产物PPH选用PES 10000超滤膜，在操作压力为0.2 MPa下进行除沉淀和大分子物质，分子量<10 KDa透过液进行PES500纳滤脱盐，测定Cl—离子浓度和根据双缩脲法测定多肽浓度，在室温，操作压力为0.5MPa条件下，进行预浓缩，期间测定Cl—离子浓度，计算脱盐率；随后加入纯水，继续进行除盐，如此反复操作三次。最终脱盐率可达到79.87%，PPH浓缩了 2.86倍；测定抗氧化肽浓度，由纳滤前的8.57 mg/mL变为浓缩后的21.51 mg/mL，纳滤过后蛋白损失率为12.15% ;对纳滤前后的样品在不同浓度下进行DPPH清除能力的测定并计算IC5tl值，纳滤后的样品IC5tl值为2.53 mg/mL,而纳滤前为2.89 mg/mL, PPH经过纳滤脱盐处理对DPPH清除能力没有下降； (2)用于制作润肤霜:将纳滤脱盐后的样品进行冷冻干燥用于润肤霜的制作，按0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的添加量分别加入到水相中，再与油相混合，即得抗氧化肽润肤霜；观察到分别在_18°C和48本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以1,1?二苯基?2?三硝基苯肼DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；该粗品PPH经Sephadex?G?25凝胶层析和两次RESOURCETM?3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，步骤为：A豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽（1）原料预处理：以豌豆分离蛋白为原料，配置质量浓度为7.5%的豌豆分离蛋白水溶液，90℃水浴15?min进行预处理，冷却备用；（2）胰蛋白酶酶解：随后放在恒温磁力搅拌器上，溶液边搅拌边调至温度40℃、pH?10，按照酶底比E/S为6%加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶活为4×104?U/g，开始水解反应，随时滴加2?M?NaOH溶液保持酶解液pH?10不变，充分酶解反应4?h后，煮沸15?min灭酶；（3）中性蛋白酶酶解：步骤（2）产物冷却后按50℃、pH?7.5，E/S为6%加入中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活为1×105?U/g，水解4?h，煮沸灭酶，冷却后用2?M?HCl溶液调pH?7；（4）离心：步骤（3）产物按照8000?r/min离心15?min去沉淀，所得上清液为豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；B?酶解豌豆抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法（5）对PPH冻干样选用Sephadex?G?25进行分离，规格为1.6?cm×60?cm，配置浓度50?mg/mL，加样量为2?mL，以纯水为洗脱剂，流速为1.5?mL/min，在280?nm处检测吸光度，在相同浓度下检测各峰DPPH自由基的清除能力；收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥；（6）选出抗氧化性高的一组分在AKTA蛋白质分析纯化仪上进行反相色谱纯化，样品溶解于含有0.05%?(v/v)?三氟乙酸TFA的水溶液中，选用RESOURCETM?3RPC色谱柱，进样量为1?mL，以2?mL/min的流速用含5%乙腈和0.05%TFA的水溶液A进行洗脱，检测波长为215?nm，使用自动收集器收集洗脱峰；5?min后，以流速为3?mL/min进行梯度洗脱，20?min时达到100%溶液B，溶液B?为含60%乙腈和0.05%TFA的水溶液，每管5?mL进行收集；富集的样品进行旋转蒸发、冷冻干燥后测各组分的DPPH清除能力；（7）?选出DPPH清除率高的组分再一次进行反相层析，溶液C为：含10%乙腈和0.05%TFA的水溶液；溶液D为：含50%乙腈和0.05%TFA的水溶液；其他条件保持不变；按峰收集样品，旋转蒸发、冷冻干燥成粉末，检测各峰的DPPH清除能力，选出活性最高的峰进行冷冻干燥；当浓度在0.2?mg?/mL时，对DPPH的清除率达到62.03%，接近于同浓度下生物体内存在的抗氧化肽GSH对DPPH的清除能力66.42%，有很强的抗氧化性；（8）利用RP?HPLC分析型色谱测定纯化后的豌豆抗氧化肽样品，在9.436?min时出现一个比较纯的洗脱峰，纯度达到90.12%；经液质联用分析推测出相对分子量为956.5?Da，氨基酸序列为Phe?Glu?Gly?Met?Thr?Phe?Leu?Leu。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田亚平，张秋萍，周锋，周楠迪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：