本发明专利技术涉及干细胞及基因工程技术领域。链接粘附分子JAM1（NM_016946）是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。本发明专利技术提供了一种促进表皮细胞增殖的方法，是用链接粘附分子JAM1基因修饰和基因干扰表皮细胞；本发明专利技术还提供了一种链接粘附分子JAM1基因低表达的表皮细胞即JAM1kd-EC，并检测了该表皮细胞的增殖能力及表皮细胞特性、生物安全性等。本发明专利技术还进一步提供上述的促进表皮细胞增殖的方法和JAM1kd-EC在创面修复或制备皮肤移植物中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞及基因工程
，具体涉及一种促进表皮细胞增殖的方法，及其将该方法应用于制备皮肤移植物。
技术介绍
细胞具有一定的寿命，细胞的分裂能力也是有一定限度的，随着细胞分裂次数的增加，细胞增殖能力逐渐减弱，最终停止增殖。这也是细胞从干细胞经过短暂扩增细胞到终末分化细胞的过程。此过程受很多因素影响，有些因素可以减缓甚至扭转这一进程，使细胞重新获得分化、增殖能力。目前，使细胞重新获得分化和增殖能力的策略有核移植(WilmutI, SchniekeAEj McWhir Jj Kind AJj CampbelI KH..Viable offspring derived from fetaland adult mammalian cells.Nature.1997 Feb 27;385 (6619):810-3.)、鸡尾酒基因修饰法(Takahashi K，Yamanaka S.1nduction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factorsCell.2006 Aug 25; 126 (4):663-76.)、细胞裂解液(Taranger CKj Noer A，S0rensenAL，Hakelien AM， Boquest AC，Collas P.1nduction of dedifferentiation, genomewidetranscriptional programming,and epigenetic reprogramming by extracts ofcarcinoma and embryonic stem cells.Mol Biol Cell.2005Dec;16 (12):5719-35.)、端粒酶转染 Comandini A, Naro C，Adamo R，Molecular mechanisms involved in HIV-1-Tatmediated inhibition of telomerase activity in human CD4 (+)T lymphocytes.Mol Immunol.2012 Dec 31; 54 (2): 181-192.)、生长因子转染(Hu ZX，Geng JMj LiangDM，Luo M，Li ML.Hepatocyte growth factor protects human embryonic stem cellderived-neural progenitors from hydrogen peroxide-1nduced apoptosis.Eur JPharmacol.20100ct25;645(l-3):23-31.)等。这些方法虽然可以让成体细胞恢复增殖能力，但存在致瘤性、细胞毒性及细 胞基因型发生改变等问题。组织工程对所需种子细胞的最基本要求就是扩增快，效率高。如何在保持原有细胞特性的基础上实现种子细胞如表皮细胞的快速、高效扩增已经成为组织工程急需解决的重点问题。近年来的研究表明慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因修饰与治疗的效果。在美国已经开展了慢病毒介导的基因治疗的临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景(Dong A, Rivella S，Breda L.Gene therapy for hemoglobinopathies:progress andchallenge.Transl Res.2013 Jan 18.pi1:S1931-5244(12)00447-1.)。链接粘附分子JAMl (GENBANK No:ΝΜ_016946)是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。JAMl可以在同源二聚化之后形成多蛋白的大的复合体，这种复合体介导细胞由外到内的信号传递。此外，JAMl在细胞增殖、迁移，器官发育等方面也有重要作用(参见文献:(I)Nava P，Capaldo CT,Koch Sj et.al.JAM-A regulates epithelial proliferationthrough Akt/β -catenin signalling.EMBO Rep.201IApr;12(4):314-20.； (2)SeversonEA，Lee WY, Capaldo C T，Nusrat A，Parkos CA.Junctional adhesion molecule Ainteracts with Afadin and PDZ-GEF2 to activate RaplAj regulate betalintegrinlevels, and enhance cell migration.Molecular Biology of the Cell Vol.20, 1916 -1925.)基因修饰可调节细胞增殖。目前较为安全的基因修饰方法是慢病毒感染。慢病毒基因载体是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒载体，作为一种高效的基因转染载体应用越来越广泛，经多次修饰改造其转导效率和安全性都得到了保证。目前尚无文献报道有关JAMl基因修饰表皮细胞，以促进其快速增殖的研究及应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种促进表皮细胞增殖的方法，本专利技术的另一目的在于提供该方法在制备皮肤移植物中的应用。申请人:基于JAMl可调节上皮细胞增殖，促进间充质干细胞增殖等实验依据，构建含目的基因JAMl的慢病毒过表达载体和JAMl特定干扰序列的慢病毒干扰载体，将其转染表皮细胞，以便用表达的外源性JAMl启动信号转导，获得JAMl高表达和低表达的表皮细胞，称之为JAM1°V-EC和JAMlkd-EC。绘制 生长曲线法测量各组细胞的增殖速度。免疫组化测量各组细胞的表皮细胞特性。裸鼠皮下注射法测量各组细胞有无致瘤性。本专利技术的主要技术方案如下:首先是根据JAMl的基因结构，设计引物，以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAMlcDNA，再构建重组人peGFP-Nl-JAMl真核表达载体，为提高转染效率，构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAMl-GFP，将慢病毒感染人表皮细胞。设计并合成引物如下:Pl:CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC (SEQ ID NO:1)P2:ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG (SEQ ID NO:2);以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAMlcDNA (SEQ ID NO: 3) 其中的慢病毒载体的构建方法为常规方法，可参见工具书(耿运琪主编，慢病毒与泡沫病毒分子生物学文选，南开大学出版社)。也可以用以下的具体步骤:(I)设计并合成引物如下:JAMl-Age 1-F 如 SEQ ID N0:4 所示，JAMl-Age 1-R 如 SEQ ID N0:5 所示，Ub1-F 如 SEQ ID NO:6 所示，EGFP-N-R 如序列 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进表皮细胞增殖的方法，是用链接粘附分子JAM1基因修饰和基因干扰表皮细胞，该方法包括：A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒；B、将步骤A获得的慢病毒去感染表皮干细胞，获得JAM1低表达的表皮细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘厚奇，仵敏娟，周童，郭晓灿，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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