一种酶法快速定量检测heparosan的方法技术

本发明专利技术提供了一种酶法快速定量检测heparosan的方法，所述方法包括：（1）取待测样品，溶于pH7.0~7.5的缓冲液中配制成样品溶液，混匀，25~35℃下平衡0.1~10min，加入足量Heparinase?III酶，混匀，25~35℃水浴0.1~3h，加入HCl溶液，离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A235nm；（2）配制梯度浓度的heparosan标准品溶液，按照步骤（1）方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线；（3）对照标准曲线，根据样品吸光度值A235nm，获得样品溶液中heparosan浓度值，换算得到样品中heparosan含量。该方法与硫酸咔唑法、干重法相比具有专一性强，精度高、重现性好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
Heparosan,又称 N-acetylheparosan, (-GlcUA-l, 4-GlcNAc-l, 4-) n,是 E.coli010:Κ5:Η4 (简称Ε.coli Κ5)等菌株荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，可作为肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。目前heparoan的检测方法主要有硫酸-咔唑法、干重法，干重法需要将细菌发酵液进行分离、醇沉、烘干、称量等步骤，最后获得的粗多糖中含有较多杂质(蛋白质、其他多糖等)，测量精度差。而硫酸咔唑法是适用范围比较广的一种糖醛酸含量的测定方法，多糖含量的测定也是通过先测定多糖中糖醛酸的含量，再换算成多糖的含量，该方法目前广泛应用于软骨素、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、黄瓜多糖、果胶多糖等酸性多糖中糖醛酸含量的测定，该测定方法易受试剂或样品中杂质(葡萄糖、盐、铁离子等)的干扰，存在操作繁琐、重现性差、干扰因素多、专一性差等缺点。而选定合适的酶，进行酶法检测具有快速、简便、专一性强和高精密度等优点，目前在实际应用中越来越广。Heparinase III酶(EC4.2.2.8)为黄杆菌(fIavobacteriu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法快速定量检测heparosan的方法，所述方法包括：（1）取待测样品，溶于pH7.0~7.5的缓冲液中配制成样品溶液，混匀，25~35℃下平衡0.1~10min，加入足量Heparinase?III酶，混匀，20~35℃水浴0.1~3h，加入HCl溶液，离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A235nm；（2）配制梯度浓度的heparosan标准品溶液，按照步骤（1）方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线；（3）对照标准曲线，根据样品吸光度值A235nm，获得样品溶液中heparosan浓度值，换算得到样品中hepa...

【技术特征摘要】
1.一种酶法快速定量检测heparosan的方法,所述方法包括: (1)取待测样品，溶于PH7.(Γ7.5的缓冲液中配制成样品溶液，混匀，25 35°C下平衡0.1 IOmin,加入足量Heparinase III酶，混勻，20 35°C水浴0.1 3h,加入HCl溶液，离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A235nm; (2)配制梯度浓度的heparosan标准品溶液，按照步骤(I)方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线； (3)对照标准曲线,根据样品吸光度值A235nm,获得样品溶液中heparosan浓度值,换算得到样品中heparosan含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)缓冲液组成如下=TrisHCll(T50mM，NaC14(T80mM，CaCl21 4mM，牛血清蛋白 0.005 0.02%，溶剂为水，ρΗ7.0 7.5。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下: (1)取待...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，黄海婵，赵颖颖，吕沈聪，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：