本发明专利技术涉及禽畜肉加热终点温度酶活检测方法及加热终点温度检测试剂盒，属于食品卫生检验领域。该试剂盒包括底物缓冲液、氧化型辅酶、２，４－二硝基苯肼、氢氧化钠和丙酮酸钠。通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于酶标仪下，检测主波长吸光度变化的情况，从而测算出禽畜肉的加热终点温度。本发明专利技术灵敏度高、精确度好、高通量，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测加热禽畜肉终点温度的试剂盒及其检测方法，属于食品卫生检验领域。
技术介绍
由于国际上各种食源性致病菌导致的恶性中毒事件接连发生，大多数中毒事件是由于生产中未按严格的卫生要求进行操作，如加热温度过低、时间过短造成的。研究表明，偶蹄动物即使感染了口蹄疫病毒等疫病，如果经一定的高温加热后，病原物即可被杀灭。研究还表明，如果对家禽肉或野生禽肉肉进行高温加热，即可杀灭禽流感病原体。因此，禽畜肉及其制品的热加工问题便引起了国际社会的关注。美国USDA的FSIS规定，用牛催化酶实验、凝乳酶实验和酸性磷酸酶活性试验等测定肉类产品是否经过适当的热处理。其中，牛催化酶实验用来检测牛肉和猪肉产品是否被加热到65℃(USDA-FSIS，1986Vb)；酸性磷酸酯酶的活性试验检测罐装火腿、野餐肉类(USDA-FSIS，1986Va)；通过检测过氧化氢酶来区分牛肉的生熟(Eye，1982)。Hunt等(1995)利用肉类提取物的反射光颜色的不同来检测其生熟度。Ellekj_r和Isaksson(1992)Ellekjaer(1992)提出利用NIR光谱仪对牛肉产品的加热终点温度进行检测。K.Thyholt等(1998)报道了利用近红外和可见光在400-2500nm的反射光谱检测加热过的牛肉产品的加热终点温度。Hsieh等通过筛选单克隆抗体，对禽畜肉中的加热终点温度进行检测。酶联免疫检测方法灵敏且高通量，但是单克隆抗体的筛选过程比较费时费力。因此，在目前食品卫生检验领域中需要一种对禽畜肉加热终点温度进行快速、高效的检测方法或产品。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种可以避免以上现有技术缺点的禽畜肉加热终点温度的检测试剂盒及其检测方法。采用该试剂盒对禽畜肉加热终点温度进行测定，测定速度快、准确度高，因此可以得到切实的推广应用。本专利技术的技术方案的原理是通过以下反应而实现的1)将样品与主要由底物缓冲液、氧化型辅酶和2，4-二硝基苯肼组成的试剂混合，使之发生如下反应 丙酮酸+2，4-二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙反应中，乳酸脱氢酶催化乳酸生成丙酮酸，然后丙酮酸与试剂中的2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙。丙酮酸二硝基苯腙在碱性溶液中呈棕红色，其颜色深浅与丙酮酸浓度呈正比。由于禽畜肉中的乳酸脱氢酶在高温下被失活，因此通过检测丙酮酸二硝基苯腙即可检测乳酸脱氢酶的含量或活性，并与已被加热到规定温度的禽畜肉的标准酶活值进行比较，最终可判断样品是否达到适当的加热温度。2)加入碱性溶液氢氧化钠后，室温放置5分钟，检测最终反应物在主波长440nm吸光度上升的幅度，了解丙酮酸的变化检测出禽畜肉产品曾经加热到的最高温度。通常步骤2)将最终反应物置于酶标仪下，检测主波长440nm吸光度值，通过与线性回归处理过的标准曲线进行比较，测算出禽畜肉加热终点温度。以上样品与试剂混合比例为按体积比1/500到1/1500，以上过程的测定温度控制在常规的30℃到40℃范围，反应时间控制在常温10-30分钟。实现本专利技术方法的禽畜肉加热终点温度检测试剂盒可以是四剂试剂1氧化型辅酶 5-15mmol/L2，4-二硝基苯肼0.5-2mmol/L；试剂2丙酮酸溶液 0.1-1.0mmol/L；试剂3强碱 0.4-5mmol/L；试剂4(包含底物缓冲液)乳酸锂 0.1-0.5mol/L pH为6.6-11.0二乙醇胺 0.1-0.3mol/L也可以是五剂试剂1氧化型辅酶 5-15mmol/L；试剂22，4-二硝基苯肼0.5-2mmol/L；试剂3丙酮酸溶液 0.1-1.0mmol/L试剂4强碱 0.4-5mmol/L；试剂5(包含底物缓冲液)乳酸锂 0.1-0.5mol/L pH为6.6-11.0二乙醇胺 0.1-0.3mol/L其中氧化型辅酶是NAD或NADP，或是NAD或NADP的衍生物。强碱是氢氧化钠或氢氧化钾。可以包括稳定剂，稳定剂是乙二醇、甘油、丙二醇、聚糖、聚醇中的一种或者几种组合。本专利技术还包括本试剂盒用于检测禽畜肉加热终点温度的方法，其使用步骤如下(1)用试剂盒中的丙酮酸、底物缓冲液、蒸馏水、2，4-二硝基苯肼配制乳酸脱氢酶酶活标准曲线； (2)分别将待测样品、标准样品、空白样品CK与各试剂的总体积比例为1/500到1/1500置于玻璃管中，测定温度控制在30℃到40℃范围，反应时间控制在常温10-30分钟，反应后用试剂盒中的氢氧化钠终止反应，室温放置5分钟，将最终反应物置于酶标仪下，检测并计算各管吸光度值与空白对照管吸光度值Bck的差值B，其中最高酶活的标准样品对应的吸光度的差值为Bmax；(3)以B/Bmax与其对应于步骤1的标准曲线的酶活绘制散点图；(4)对散点图进行线性回归处理，得到回归方程，并根据回归方程计算出待测样品的乳酸脱氢酶酶活；(5)比较待测样品的乳酸脱氢酶酶活与加热禽畜肉的标准酶活值，当待测样品酶活高于标准酶活值，判断禽畜肉加热终点温度未达到规定的温度；当待测样品酶活低于标准酶活值，判断禽畜肉加热终点温度达到规定的温度。其中规定的加热温度终点达到70℃的猪肉和牛肉的标准酶活值分别为3157±62U/L和132±6.2U/L。本专利技术还包括所述的试剂盒在检测禽畜肉加热终点温度方面的用途以及所述的方法在检测禽畜肉加热终点温度方面的用途。详细检测过程如下检验方法1)标准曲线的绘制表1标准曲线绘制方法 2)样品检验方法蛋白粗提物的制备样品(来源于待检样品几何中心的样品)去除脂肪和结绨组织，加3倍体积预冷的PBS，冰浴中进行匀浆，呈肉糜状，然后4℃6000r/min离心10分钟，取上清，滤纸过滤。再4℃13000r/min离心10分钟，取其上清为牛肉样品的蛋白粗提物。测定时按照表2的方法操作，表2酶活测定方法 将上述溶液在96孔板中混匀，37℃水浴10-30分钟，加入一定量氢氧化钠溶液，室温放置5分钟后，波长440nm测定，检测并计算各管吸光度值与空白对照管吸光度值Bck的差值B，其中最高酶活的标准样品对应的吸光度的差值为Bmax；以B/Bmax与其对应于标准曲线的酶活绘制散点图；对散点图进行线性回归处理，得到回归方程，并根据回归方程计算出待测样品的乳酸脱氢酶酶活。3)结果判断方法比较待测样品的乳酸脱氢酶酶活与加热禽畜肉的标准酶活值，当待测样品酶活高于标准酶活值，判断禽畜肉加热终点温度未达到规定的温度；当待测样品酶活低于标准酶活值，判断禽畜肉加热终点温度达到规定的温度。应当理解的是，由于不同禽畜肉的规定的加热温度不同，其标准酶活值也不同。但是对于某种禽畜肉而言，如果确定某种温度是符合要求的温度，并且由于测量标准酶活方法属于本
的常规方法，因此该温度下禽畜肉的标准酶活值可以也应是已知的。另外，由于相同禽畜肉在不同的加工方式(如熏、烤、煮、腌、炸等)下其标准酶活值也不同。但是对于某种已知加工方式的禽畜肉而言，如果确定某种温度是符合要求的温度，因此该温度下禽畜肉的标准酶活值可以也应是已知的。以猪肉和牛肉为例，猪和牛酶活性检测方法，加热终点温度达70℃要求后，用常规方法测量其肌肉组织中的乳酸脱氢酶(LDH)活性分别为3157±62U/L和132±6.2U/L，如果待测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测禽畜肉加热终点温度的试剂盒，其特征在于，包括：试剂１氧化型辅酶５－１５ｍｍｏｌ／Ｌ２，４－二硝基苯肼０．５－２ｍｍｏｌ／Ｌ；试剂２丙酮酸溶液０．１－１．０ｍｍｏｌ／Ｌ； 试剂３强碱０．４－５ｍｍｏｌ／Ｌ；试剂４（包含底物缓冲液）乳酸锂０．１－０．５ｍｍｏｌ／ＬｐＨ为６．６－１１．０二乙醇胺０．１－０．３ｍｍｏｌ／Ｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑文杰，贺艳，刘烜，赵卫东，刘伟，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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