本发明专利技术涉及聚乙二醇生物降解技术领域，具体地说是一种聚乙二醇水解菌株及水解能力的验证方法。聚乙二醇水解菌为革兰氏染色反应阴性菌PEGHB-04，经鉴定为无色杆菌属（Achromobactersp.）。主要生物学特性为G-，杆状，无芽孢，大小0.8~1.3×0.5~0.6μm；对明胶水解、淀粉水解、接触酶呈阳性；对硝酸盐还原、M.R试验、V.P试验、吲哚试验呈阴性。利用液相色谱串联质谱联用分析（LC-MS）验证菌株对聚乙二醇的水解能力。本发明专利技术提供了一种高效聚乙二醇水解菌，为聚乙二醇降解混合菌剂的制备提供了有效的菌株资源，并提出了聚乙二醇水解菌的高效可靠的鉴定方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及环境微生物
，具体地说是一种聚乙二醇水解无色杆菌PEGHB-04及其应用。
技术介绍
聚乙二醇(PEG)又称聚乙二醇醚，化学结构式为H (CH2CH2OCH2CH2)nOH,它包括一系列由低到中等分子量的产品，其相对分子质量范围从200到20000。通常工业生产中是以环氧已烷与乙二醇或者水慢慢加成而获得，因为蒸汽压大小的原因，我们通常得到的聚乙二醇产品均为不同聚合度的聚乙二醇的混合物。聚乙二醇具备润滑、水溶、稳定、低毒、难挥发、易互溶等优越的性能，而且该聚合物的分子量有可变性，从而它被广泛应用于医药品、化妆品、润滑剂、防冻剂的生产，并大量用作非离子型表面活性剂和多晶硅切 割液。全球范围内每年生产数百万吨的聚乙二醇，并且绝大部分最终进入水体环境中，造成严重的环境污染。一般来说，聚乙二醇相对分子量越大，生物降解越难，分子量越小，则较容易进行生物降解。目前，国内外研究报道主要为单株或者多株菌株协同降解聚乙二醇，但这些报道的菌株对大分子量聚乙二醇降解速率较慢。因此，聚乙二醇水解菌对提高聚乙二醇生化降解速率具有十分重要的意义，但目前仍未见聚乙二醇水解菌株及水解能力验证方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对大分子量聚乙二醇降解速率较慢，提供了一种聚乙二醇水解无色杆菌PEGHB-04及其应用。本专利技术提供了一种聚乙二醇水解菌株，其菌株PEGHB-04是一株革兰氏阴性菌,于2013年I月15日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC N0.7142，经鉴定为无色杆菌属sp.)。主要生物学特性为在LB固体培养基上，培养基配方为:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，琼脂20.00g，去离子水1000ml，pH 7.0，30°C恒温培养3天后，其菌落为圆形，边缘光滑；经结晶紫染色后，在显微镜下观察菌为杆状，无芽孢，大小0.8^1.3X0.5、.6μπι;对明胶水解、淀粉水解、接触酶呈阳性；对硝酸盐还原、Μ.R试验、V.P试验、吲哚试验呈阴性。本专利技术提供了聚乙二醇水解菌株PEGHB-04在聚乙二醇水解中的应用。本专利技术还提供了一种菌株PEGHB-04水解聚乙二醇的方法，包括如下步骤: 1)将纯化得到的菌株挑至诱导培养基中，于30°C、160r/min振荡培养至菌体生长对数后期，即 0D600 ^ 2.5 ； 2)将步骤I)得到的培养液在离心力6000g下离心3min,弃上清液,加入等体积的IOOmmoI/L, pH7.0的磷酸缓冲液PBS摇匀后，在离心力6 OOOg下离心3min，以此方法冲洗2次，然后用IOOml无机盐液体培养基重悬； 3)在步骤2)的IOOml重悬液中加入0.5g PEG1000,即聚乙二醇1000，并于30°C、160r/min下振荡18 h。所述步骤I)中的诱导培养基的组成为:PEG1000 5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，酵母膏 4.0g，去离子水 1000ml，pH 7.0。所述步骤2)中的无机盐液体培养基为:每升去离子水中含1.50 g Κ2ΗΡ04、0.50 gKH2PO4^0.20 g MgS04X7H20、l.00 g NaClU.00 g (NH4)2SO4, pH 7.0。本专利技术所有具有的优点: 1)本专利技术提供的一种聚乙二醇水解菌，大大提高聚乙二醇生物降解效率，在实践中具有很好的应用前景； 2)本专利技术采用的LC-MS验证聚乙二醇水解能力，技术先进，高效精准，稳定可靠，具有很好可行性和推广性； 3)本专利技术确定了聚乙二醇LC-MS分析的基本条件，为其他聚合物的相关分析提供了一定的理论指导。附图说明图1聚乙二醇水解菌PEGHB-04菌落照片。图2聚乙二醇水解菌PEGHB-04菌体结晶紫染色照片(1000X)。图3 PEG1000水解前后的LC-MS图谱； 其中:A.PEG1000水解前；B.PEG1000被菌株水解后。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1聚乙二醇水解菌PEGHB-04的筛选与分离 取被聚乙二醇长期污染的土壤5.0g,加入至含PEG1000浓度为1000mg/L的IOOml无机盐培养基中，无机盐培养基配方为:每升去离子水中含1.50 g Κ2ΗΡ04、0.50 g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4X 7H20U.00 g NaClU.00 g (NH4)2SO4, pH 7.0，于 160r/min，30°C条件下振荡培养，每隔3天按5%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接4次。取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0ml配好的KT1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10_2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于PEG1000的浓度为1000mg/L无机盐固体培养基上，固体培养基配方为:每升去离子水中含 1.50 g K2HPO4^0.50 g KH2PO4^0.20 g MgSO4X 7H20、1.00 g NaClU.00 g(NH4)2SO4, 20.0Og琼脂， pH 7.0，30°C恒温培养3天。3天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于LB固体培养基中划线分离纯化，LB固体培养基配方:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，琼脂20.00，去离子水1000ml, pH 7.0。将纯化后的单菌分别接种至含PEG1000浓度为5000mg/L的LB液体培养基中，LB培养基配方为:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，去离子水1000ml, pH 7.0，于30°C、160/min振荡培养至菌体生长对数后期，即0D600 乂 2.5。将得到的培养液在离心力6000g下离心3min，弃上清液，用pH7.0的lOOmmol/L磷酸缓冲液PBS冲洗2次，再用IOOml无机盐液体培养基重悬，再往该重悬液中加入0.50g PEG1000,于30°C、160r/min下振荡18 h，离心去除菌体，用LC-MS分析验证菌株对PEG1000是否有水解能力。选取水解能力较高的菌株进行后续试验。将降解菌株接种于LB固体培养基上，30°C恒温培养30h后观察菌落形态,用光学显微镜观察菌体形态(1000X)。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。其菌落图片见图1，特征为圆形，边缘光滑，鉴定为无色杆菌属sp.),命名为PEGHB-04，主要生物学特性为格兰氏阴性，结晶紫染色照片如图2所示，杆状，无芽孢，大小0.8^1.3X0.5^0.6 μ m ;对明胶水解、淀粉水解、接触酶呈阳性；对硝酸盐还原、M.R试验、V.P试验、吲哚试验呈阴性。实施例2菌株PEGHB-04水解聚乙二醇的方法 将菌株PEGHB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株聚乙二醇水解无色杆菌（Achromobacter?sp.）菌株PEGHB?04，其保藏编号为CGMCC?NO.7142。
【技术特征摘要】
1.一株聚乙二醇水解无色杆菌sp.)菌株PEGHB-04,其保藏编号为CGMCC N0.7142。2.权利要求1所述的无色杆菌PEGHB-04在聚乙二醇水解中的应用。3.权利要求1所述的无色杆菌PEGHB-04水解聚乙二醇的方法，包括如下步骤: 1)将纯化得到的菌株挑至诱导培养基中，于30°C、160r/min振荡培养至菌体生长对数后期，即 0D600 ≈ 2.5 ； 2)将步骤I)得到的培养液在离心力6000g下离心3min,弃上清液,加入等体积的100mmoI/L, pH7.0的磷酸缓冲液PBS摇匀后，在离心力6000下离心3min，以此方法冲洗2次，然后用IOOml无机盐液体培养基重悬； 3...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈立伟，李根，蔡天明，胡江，张金，杨倩，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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