本发明专利技术涉及一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1活菌制剂的制备方法，适用于家禽畜牧业中饲用功能性活菌制剂等微生态制剂的生产。本发明专利技术利用筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KL1菌株，经过活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩、加入冻干保护剂、预冻和冷冻干燥等工序制备活菌制剂。本发明专利技术利用全自动发酵罐优化发酵条件，并利用马铃薯粉浆作为冻干保护基质，确定冻干保护剂较优组合配方，使KL1菌株的活菌数量可达1010CFU/g以上，存活率达到85％以上。本发明专利技术制备的活菌制剂价格低廉，活菌含量高，可作为家禽饲料添加剂，具有鸡生长速度快、饲料用量省、少生病等特点。它不仅有降低鸡蛋胆固醇的效果，而且具有调节鸡的肠道菌群平衡作用，对鸡白痢有较好预防和治疗作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及产胆盐水解酶干酪乳杆菌KLl活菌制剂的制备方法，适用于家禽畜牧业中饲用功能性活菌制剂等微生态制剂的生产。
技术介绍
本专利技术涉及的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KLl是从开菲尔粒中分离纯化出来的一种具有降低胆固醇作用的乳酸菌。“藏灵燕”(Tibetan Kefir, TK)又称开菲尔粒，19世纪被人类发现。开菲尔粒起源于俄罗斯北高加索地区，当地牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳酒，其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵，经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状物体，即为开菲尔粒。此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中，使之发酵成具有爽快酸味和起泡性的保健饮料，即为开菲尔。开菲尔具有多种保健功效。开菲尔中的活菌对志贺氏菌、沙门氏菌等病原菌的生长有强烈抑制作用；其中的酵母菌对结核杆菌、大肠杆菌有较强抗菌活性。故开菲尔对肠道疾病、肺结核有很好疗效。此外，开菲尔中的乳酸菌产生的代谢产物，如胞外多糖、胆盐水解酶等能有效预防肿瘤和高血脂症的发生。在藏灵菇的黏多糖基质中微生物菌相主要以乳酸菌、酵母菌及少量醋酸菌为基础的小生态系。本专利技术所用干酪乳杆菌KLl是从藏灵菇中分离纯化出来的一种益生乳酸菌，可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实验证明有降低机体血清总胆固醇含量的功效。其降低胆固醇机理是缘于干酪乳杆菌KLl代谢产生的胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase, BSH)。BSH是肠道中的双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的多种乳酸细菌在生长过程中产生的代谢产物。大量实验证明，胆盐水解酶能在肝肠循环中将结合胆盐分解，产生氨基酸与溶解度较低的游离胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理的研究尚存在不同观点，主要集中于以下三点:(1)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；(2)乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；(3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。目前，国内申请各种活菌制剂制备方法的专利较多，如江苏省微生物研究所有限责任公司唐宝英和朱晓慧申请的“酪酸菌活菌制剂及其制备方法”(CN101032527)是由酪酸菌制备的人兽两用活菌制剂；上海信谊药业有限公司陈彬华和姚义强申请的“双歧三联活菌制剂及制备方法”(CN98110623.4)是由两歧双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌冷冻干燥活菌粉作为活性成份与保护剂组成的；上海环伟生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的“一种复合微生物活菌制剂及其制备方法和应用”(ZL200810034746)是利用片球菌、酵母菌和芽孢杆菌分别液体扩大培养，然后按所需比例混合，经固态发酵、干燥、粉碎制得的一种复合微生物活菌制剂。但关于利用分离筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KLl制备活菌制剂，利用自动发酵罐高密度发酵，以及利用马铃薯粉浆保存生物制剂中活菌的方法尚未见国内外相关文献报道和专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KLl菌种制备活菌制剂的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的:所述方法中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) KLl分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，并已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为=CGMCC N0.1809(菌株KLl)。在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上,干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KLl菌株的菌落大小2 3mm，表面粗糙如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明，菌落有较高黏性；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，有时菌体呈球形，G+无芽孢杆菌。所述方法中，将脱脂乳试管保种的干酪乳杆菌KLl菌株以新鲜灭菌脱脂乳于37°C培养12h，至脱脂乳凝固，如此活化2 3代后，冷藏备用。所述方法中，在上述试验的基础上，将活化好的菌液以2% (V/V，体积分数)的接种量移种至改良MRS培养基中，于37°C培养12h，得到扩大培养液。所述方法中，在上述试验结果基础上，采用三因素三水平正交试验优化发酵条件。将2L改良MRS培养基加入到5L全自动发酵罐中，利用发酵罐灭菌系统于115°C灭菌15min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将KLl菌株的扩大培养液按3% (V/V，体积分数)的接种量移种至发酵罐中，利用发酵罐自动控温系统维持发酵温度为40°C，发酵过程中以流加10 % (W/V，质量体积比浓度)的灭菌N%C03溶液控制发酵液pH6.4，搅拌转速为55r/min，发酵20h，得到发酵液。上述方法中，改良MRS培养基成分:葡萄糖10g、大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母干粉5g、朽1檬酸二铵2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸猛0.25g、吐温 _801mL、蒸馏水 IOOOmL,调节 pH 为 6.4。上述方法中，5L发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为B10F6005GBN。所述方法中，在上述试验结果基础上，将2L发酵液于4°C条件下，5000r/min离心15min,弃上清液,收集得到菌泥。所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥平均加入2只盛有IOOmL马铃薯粉浆(冻干保护基质)的600mL冻干瓶中，加入3.5%谷氨酸钠、2.0%脱脂奶粉和1.5%甘油作为冻干保护剂，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂。上述方法中，采用单因素多水平试验，确定干酪乳杆菌KLl的冻干保护剂较优组合配方为(W/ν，质量体积比浓度):3.5%谷氨酸钠+2.0%脱脂奶粉(伊利)+1.5%甘油(V/V,体积分数)。上述方法中，将新鲜去皮马铃薯以九阳牌食物料理机打浆，即成为马铃薯粉浆。 所述方法中，将浓缩活菌制剂于_34°C预冻15h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。所述方法中，在上述试验结果基础上，利用6L LABC0NC0真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于冻干温度_55°C、真空度0.16mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂。所述方法中，所得产胆盐水解酶干酪乳杆菌KLl活菌制剂的活菌数量可达1010CFU/g以上，菌种存活率可达85%以上。此种活菌制剂由于用马铃薯粉浆作为冻干保护基质，使产品价格低廉，活菌含量高，可作为家禽饲料添加剂，具有鸡生长速度快、饲料用量省、少生病等特点。它不仅有降低鸡蛋胆固醇的效果，而且具有调节鸡的肠道菌群平衡作用，对鸡白痢有较好预防和治疗作用。上述方法得到的产胆盐水解酶干酪乳杆菌KLl活菌制剂及其制备方法属于本专利技术保护范围。具体实施例方式下述实施例对本专利技术作进一步说明而不限制本专利技术的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。实施例1、产胆盐水解酶干酪乳杆菌KLl活菌制剂的制备方法1、菌种的活化和扩大培养将脱脂乳试管保种的干酪乳杆菌KL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用菌株KL1CGMCC?No.1809为干酪乳杆菌(Lactobacillus?casei)的产胆盐水解酶乳酸菌制备活菌制剂的方法，其特征在于：将干酪乳杆菌KL1扩大培养液按3％的接种量移种至2L改良MRS发酵培养基中，利用5L全自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度40℃，发酵液pH6.4，搅拌转速55r/min，发酵时间20h，得到发酵液；将发酵液于4℃、5000r/min离心15min，收集得到菌泥；在600mL冻干瓶中按离心前发酵液1/10体积的量，加入马铃薯粉浆作为冻干保护基质，再加入3.5％谷氨酸钠、2.0％脱脂奶粉和1.5％甘油的冻干保护剂与收集的菌泥，混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将每个冻干瓶装量为100mL的浓缩发酵剂于?34℃预冻15h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂；利用美国产6L?LABCONCO真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于?55℃、真空度0.16mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到干酪乳杆菌KL1冻干活菌制剂。
【技术特征摘要】
1.一种利用菌株KL1CGMCC N0.1809为干酿乳杆菌(Lactobacillus casei)的产胆盐水解酶乳酸菌制备活菌制剂的方法，其特征在于:将干酪乳杆菌KLl扩大培养液按3%的接种量移种至2L改良MRS发酵培养基中，利用5L全自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度40°C，发酵液pH6.4，搅拌转速55r/min，发酵时间20h，得到发酵液；将发酵液于4°C、5000r/min离心15min，收集得到菌泥；在600mL...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧，谢远红，张红星，周妍，熊利霞，高秀芝，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：
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