本发明专利技术公开了一种用于禽肺病毒A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒A亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2所示，所述的探针序列如SEQ ID NO.3所示。使用本发明专利技术的试剂盒能够实现对禽肺病毒A亚群病毒的检测，本发明专利技术的试剂盒在1×103～1×109个拷贝·μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到102个拷贝·μL-1，是普通RT-PCR方法的100倍，且与其他禽病病毒无交叉反应。结果表明，本发明专利技术的试剂盒具有良好的敏感性和特异性，可用于禽肺病毒A亚群的定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种荧光定量RT-PCR检测试剂盒，特别涉及一种用于禽肺病毒A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用，属于病毒检测领域。
技术介绍
禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)又称火鸡鼻气管炎病毒(turkyrhinotracheits virus, TRTV)。禽肺病毒属于副粘病毒科，肺病毒亚科，偏肺病毒亚属。禽肺病毒引起的疾病最早在火鸡上发现，该病毒引起火鸡的呼吸道疾病并导致产蛋量下降。在鸡上禽肺病毒是引起肿头综合征的重要因素，但APV的致死率不高(2% 5%)。自1978年南非首次报道APV，欧洲和中东多次报道APV，在世界的许多地方APV对火鸡和鸡造成严重的威胁。根据编码禽肺病毒G蛋白的基因不同将欧洲病毒株分为两个亚型，即A亚型APV (APV/A)(英国)和B亚型APV (APV/B)(欧洲大陆)。APV/A亚型与APV/B亚型相似，但G蛋白只有38%的相似率，这两个亚型在欧洲广泛流行。APV/A亚型在南非和英格兰首次分离到:在亚洲的日本、韩国、黎巴嫩和以色列等国家有针对于APV/A亚型的报道。我们对国内的鸡群进行了禽肺病毒血清学调查，结果显示APV普遍感染，发现有的祖代种鸡场的抗体阳性率有的高达100%，这应该引起中国养禽业的足够重视。但尚未知道是哪一种亚型的APV引起的，建立一种快速、灵敏的诊断方法且能快速分型对诊断和控制APV极为重要。尤其是APV/A亚群，中国临近国家如日本、韩国和以色列等已有APV/A亚群的流行的报道，极有可能对中国的养鸡业造成危害。在2008年已有报道在中国东南方的鸡市场检测到APV/A亚群。因此建立一种针对APV/A亚群的高效的诊断方法是当务之急。荧光定量PCR是近年来发展起来的新技术，具有快速、灵敏、特异性强等优点，非常适用于病毒感染的检测，尤其是感染的早期诊断，该方法不仅能精确定量，而且由于其具有探针与引物的双重特异性，从而减少了假阳性。目前，APV的实验室常规诊断方法主要是RT-PCR，但是该方法在用于APV检测时仍在敏感性、特异性和时效性等方面均存在不足，特别是在该病的早期诊断中体现得尤为明显。本研究为针对A亚群APV检测的荧光定量RT-PCR的检测试剂盒及其应用，本专利技术的检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性，方便快捷且同时能够区分亚群，为APV的早期、分型检测提供了强有力的诊断方法，同时为APV感染、增殖规律的研究提供了重要的检测技术手段，对APV的临床诊断和致病机理的研究具有一定应用价值。
技术实现思路
本专利技术 所要解决的技术问题是提供一种用于禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。为达到以上目的，本专利技术采用的技术手段为:根据GenBank中，禽肺病毒A亚群序列设计I对针对G基因的引物和I条特异性TaqMan探针，建立了一种快速检测APV A亚群病毒载量的特异性TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并组装了试剂盒。通过对反应条件和反应体系的优化，使得使用本专利技术的试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测在IXlO3 IX IO9个拷贝.μ L—1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到IO2个拷贝.μ L_\是常规RT-PCR方法的100倍，而且与常规RT-PCR方法相比(BA YON-AUBOYER M, JESTIN V，TOQUIN D, et al Comparison of F-, G-and N-basedRT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detectionand typing of turkey rhinotracheitis virus.Arch Virol，1999，144:1091—1109 ;或 DAR A Mj TUNE Kj MUNIR S，et al,PCR-based detection of an emerging avianpneumovirus in US turkey flocks, J Vet Diagn Invest，2001，13(3):201-205 ;或GHARAIBEHIS M，ALGHARAIBEHG Rj Serological and Molecular Detection of AvianPneumovirus in Chickens with Respiratory Disease in Jordan, Poultry science，2007，86 (6): 1677-1681)，使用本专利技术的试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测可对结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。试验表明，使用本专利技术的试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测与其他禽病病毒无交叉反应，且A亚群的荧光定量RT-PCR与其他亚群的RNA标准品不反应，说明本专利技术试剂盒具有良好的敏感性和特异性。将备检样品提取RNA后，不用反转录，直接进行荧光定量RT-PCR反应，利用所建立的荧光定量RT-PCR检测试剂盒可以在2h内快速准确地对APV A亚群进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量，而且能够将阳性样品的亚群进行准确的判断。本专利技术的一种用于禽肺病毒A亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒A亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如下所示:上游引物:5’GGTACATATTGGCTATAGTC3’(SEQID N0.1 所示)下游引物:5’CTCCTCCATTGTAGTTTCTGCACTCC3’(SEQID N0.2 所示)所述的探针序列如下所示:5’FAM-GTTAGCGTCATAGTTGAACAGTCAGTGTTAG-TAMRA3’ (SEQ ID N0.3 所示)。在本专利技术中，所述的试剂盒中还可包括反应混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的双蒸水。其中，反应混合液中包含有PCR扩增所需要的成分:25mmol/L MgCl2以及IOmmol/L dNTPs。所述的反应混合液可为 2XQuantiTect Probe RT-PCR Master Mix,购自 Qiagen公司。进一步的，本专利技术还提出了所述的试剂盒在制备禽肺病毒A亚群检测试剂中的应用。及所述的试剂盒在制备以禽肺病毒G基因为靶点区分禽肺病毒亚群试剂中的应用。附图说明图1为荧光定量RT-PCR的动力学曲线；图2为荧光定量 RT-PCR的标准曲线；图3为常规RT-PCR的敏感性试验；图4为使用荧光定量RT-PCR对APV的A、B和C亚群的G基因以及B亚群病毒进行扩增的动力学曲线。具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本专利技术做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本专利技术的保护范围。实施例1本专利技术试剂盒中探针及引物序列的设计和合成根据GenBank中APV的A亚群的G基因序列(GenBank登录号为GA:AY640317.1)设计I对分别针对目的基因的上下游引物:上游引物GAF: 5’ GGTACATATTGGCTATAGTC3’下游引物GAR: 5’ CTCCTCCAT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于禽肺病毒A亚群特异性检测的荧光定量RT‑PCR试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒A亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如下所示：上游引物：5'GGTACATATTGGCTATAGTC3'下游引物：5'CTCCTCCATTGTAGTTTCTGCACTCC3'所述的探针序列如下所示：5'FAM‑GTTAGCGTCATAGTTGAACAGTCAGTGTTAG‑TAMRA3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高玉龙，王笑梅，秦立廷，王永强，祁小乐，高宏雷，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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