本发明专利技术公开了一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法，根据两种病毒基因序列的异同点设计了三条引物反向引物CWWY-R2为：5′-GGTTCCMGTTATCGTACT-3′。正向引物CW1-F2：5′-GGAAGGGATGCCATACAACT-3′，WY1-F2：5′-ACCCTACAAACAAACTCTGC-3′，植物总RNA为模板，以CWWY-R2为引物，反转录合成cDNA。然后通过优化建立了一种同步检测两种病毒的反应体系：cDNA1.6μL、引物(10μmol/L)各0.4μL、10×PCR Buffer(不含Mg2+)2μL、dNTPs(10mmol/L each)0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.8μL、MgCl2(25mmol)0.8μL、ddH2O 13.2μL合计20μL；PCR反应条件：94℃预变性5min、94℃50s、50℃50s、72℃90s共30个循环，72℃延伸10min。PCR扩增预期目的片段分别为WYMV 508bp、CWMV 918bp。利用该方法对江苏高邮、扬州和大丰的样本进行检测，分别为WYMV、WYMV、CWMV单一侵染。
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术涉及及其在农业上的应用，属于农业科学
技术介绍
:小麦是全世界最主要的粮食作物之一，其中麦类病毒病是影响其生产的主要因子之一。迄今为止由禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)传播的小麦类病毒主要有真菌传杆状病毒属(Furovirus)的中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaicvirus,CWMV)、小麦土传花叶病毒(Soil-bome wheat mosaic virus, SBWMV)、土传禾谷类花叶病毒(Soil-bomecereal mosaic virus, SBCMV)和大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的小麦黄花叶病毒(Wheatyellow mosaic virus, WYMV)和小麦梭条斑花叶病毒(Wheat spindle streak mosaicvirus，WSSMV)。其中SBWMV主要分布于美国、法国、意大利和日本，SBCMV分布于法国、英国和美国，WSSMV分布于加拿大、美国和法国等欧美国家，在中国小麦上发生的主要是WYMV和CWMV,其中WYMV在日本亦有分布。WYMV 基因组由 2 条单链 RNA (single-stranded RNAs, ssRNA)组成，分别是RNAl (7636 nt)和RNA2 (3659 nt)。WYMV在中国的冬小麦种植区如江苏、河南、陕西、四川、湖北、安徽、浙江和山东等地广泛分布，一般造成小麦产量损失20% -70%，甚至绝收。CWMV是近年来在中国新发现的一种小麦病毒，该病毒基因组为RNAl(7147nt)和RNA2 (3569nt)组成。该病毒早期被误认为是SBWMV，经全基因组测序发现CWMV和SBWMV的RNAl和RNA2核苷酸序列同源性分别为75%和63%，编码蛋白氨基酸序列的同源性分别为84%和62%，两者存在明显差异。在中国目前主要分布于山东、江苏，常与WYMV复合感染。目前对WYMV和CWMV主要采用血清学方法和分子生物学方法对两种病毒单独检测，如型怡明用间接酶联和直接DAS酶联法检测WYMV，张宗英利用RT-PCR、ELISA和Westernblotting等检测河南驻马店小麦样上的WYMV，尚巧霞利用ELISA+RT-PCR方法对四川小麦中的WYMV进行检测，耿波用双抗夹心方法检测WYMV，刘晓军初步建立CWMV的RT-LAMP检测体系。为简化试验步骤，近年来在植物上利用多重RT-PCR同时检测多种病毒的方法发展较快，如岳红妮成功从复合侵染的小麦材料中检测大麦条纹花叶病毒(Barleystripe mosaicvirus, BSMV)、大麦黄矮病毒 PAV 株系(Barley yellow dwarf virus, BYDV-PAV)、WYMV 及小麦蓝矮植原体(Wheat blue dwarf，WBD)，Mahua Deb建立一种多重RT-PCR同时检测大麦小麦黄矮病毒(Barley and Cereal ye I lowdwarf virus, B/CYDV) 5 个株系、WSSMV、SBWMV和小麦线条花叶病毒(Wheatstreak mosaic virus,WSMV)8种麦类病毒,而从复合侵染样品中同时检测WYMV和CWMV两种病毒尚未有报道。WYMV和CWMV侵染小麦的症状主要为叶片黄化或花叶，植株矮化，进一步发展直至枯萎死亡，均由禾谷多黏菌传播，其生物学特性十分相似，难以从经验观察的角度有效区分，且CWMV常与WYMV复合侵染，增加了病害诊断的难度。为了能快速准确诊病害类型， 本研究试图建立一种能从小麦病叶中同步检测WYMV和CWMV的方法，以方便快捷诊断田间小麦的侵染状况，为病害科学防治提供依据
技术实现思路
:本专利技术提供了。许多学者利用传统生物学接种鉴定、分子生物学和血清学方法单独检测小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV)，本专利技术是首次利用多重RT-RCR从复合侵染样品中同时检测WYMV和CWMV两种病毒。本专利技术所提供的，是通过以下方法获得的:1)根据NCBI已报道的小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒核苷酸序列,通过软件 Primer Premier 5.0 设计引物；2) Trizol reagent 法提取植株总 RNA ;3)以CWWY-R2为引物，参照M-MuLV反转录酶使用说明反转录合成cDNA ； 4)优化多重RT-PCR反应体系(dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度和Mg2+浓度)和反应条件(退火温度、循环次数和延伸时间)；5)在最佳反应参数条件下，以江苏省农科院植保所病害室保存的WYMV和CWMV提纯病毒为阳性对照验证这一方法的准确性。本专利技术提供的引物序列如下:权利要求1.，其特征在于:利用简并引物,在优化的多重RT-PCR反应系统中同时检测这两种病毒。.2.1中所述的简并引物是指:全文摘要本专利技术公开了，根据两种病毒基因序列的异同点设计了三条引物反向引物CWWY-R2为5′-GGTTCCMGTTATCGTACT-3′。正向引物CW1-F25′-GGAAGGGATGCCATACAACT-3′，WY1-F25′-ACCCTACAAACAAACTCTGC-3′，植物总RNA为模板，以CWWY-R2为引物，反转录合成cDNA。然后通过优化建立了一种同步检测两种病毒的反应体系cDNA1.6μL、引物(10μmol/L)各0.4μL、10×PCR Buffer(不含Mg2+)2μL、dNTPs(10mmol/L each)0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.8μL、MgCl2(25mmol)0.8μL、ddH2O 13.2μL合计20μL；PCR反应条件94℃预变性5min、94℃50s、50℃50s、72℃90s共30个循环，72℃延伸10min。PCR扩增预期目的片段分别为WYMV 508bp、CWMV 918bp。利用该方法对江苏高邮、扬州和大丰的样本进行检测，分别为WYMV、WYMV、CWMV单一侵染。文档编号C12Q1/68GK103103288SQ20131000043公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日专利技术者缪倩, 季英华, 任春梅, 魏利辉, 周益军, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法，其特征在于：利用简并引物，在优化的多重RT‑PCR反应系统中同时检测这两种病毒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：缪倩，季英华，任春梅，魏利辉，周益军，程兆榜，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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