本发明专利技术涉及一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，包括：（1）使用Trizol试剂将脑组织进行总RNA的分离；（2）对步骤（1）得到的总RNA进行反转录，得到的cDNA；（3）将上述cDNA与SYBR荧光染料混合并进行扩增；（4）IBSP的表达通过抗GAPDH进行标准化，使用方程进行比较阈值循环法；（5）构建组织芯片，然后进行免疫组化染色，对免疫组化结果进行统计分析，检测BSP在脑胶质瘤中的表达。本发明专利技术的方法使得检测BSP的表达的灵敏性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息；检测BSP的表达具有重要的医学价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检测BSP在脑胶质瘤中的表达领域，特别涉及一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法。
技术介绍
胶质瘤是中枢神经系统(CNS)中最多见的肿瘤，其中70%是恶性胶质瘤，是CNS起源的肿瘤中最常见和最致命的肿瘤，具有高复发率和死亡率。胶质瘤中最有生物学侵袭性的亚型是多形性胶质母细胞瘤(GBM，WHO IV级的星形胶质细胞瘤)，其预后令人沮丧。目前的标准治疗方案包括最大程度的切除肿瘤以及随后使用DNA烷化剂、替莫唑胺进行化疗和放疗。但尽管经过上述的有效治疗，GBM和间变型星形细胞瘤(WHO III级)的预后生存期仍很短，中位生存期分别只有约14-16个月和2-5年。目前已做了大量的 努力来鉴定GBM中的基因学变化或其分子靶标，这些基因变化或分子靶标有助于区分GBM患者的不同亚组，每个亚组有不同的预后和对特异性治疗不同的临床反应。替莫唑胺临床反应最主要的决定因素之一是MGMT的甲基化水平。MGMT启动子甲基化可见于40%-60%的病人，并与对替莫唑胺治疗的良好反应相关。最近，在多达75%的2级和3级弥漫性星形细胞瘤中发现了基因编码的异柠檬酸脱氢酶(IDHl)的突变，目前已发现IDHl的突变是2-4级胶质瘤总体生存期和无进展生存期的一个主要的预后指标。肿瘤的侵袭能力通常可通过癌细胞的高运动性和用于降低胞外基质的蛋白酶的表达量增加来预测。骨唾液蛋白(BSP)作为基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)的一个特异性的调控者，由IBSP基因编码，属于小型N端连接整合糖蛋白(SIBLING)基因家族一员。BSP在诸如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种癌症中都是高表达的，并可能有助于这些癌的侵袭潜能。一项早期的研究表明BSP对于临床局限的前列腺恶性腺癌在统计学上有显著的预后价值。类似的结果在非小细胞肺癌、乳腺癌、人类上皮癌、胰腺癌和骨肉瘤中都有发现。但在胶质瘤组织中尚未有BSP的表达及其预后价值的研究。组织芯片(TMA)技术的发展，得益于生物芯片技术等的延伸。TMA具有高通量、快速、低误差、用途广泛等特点，目前主要应用在肿瘤病理学、实验室检测、药物研究等。利用组织芯片技术可以在细胞水平定位和蛋白水平检测相应靶标，从而实现基因及其表达产物与组织形态学研究以及临床数据相结合，同时还可以与原位杂交技术等相结合，因此TMA被广泛应用在肿瘤病理研究中，例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的关系，AlphaB-Crystallin与乳癌的关系，TMPRSS2和ETS转移因子在前列腺癌的重要作用等。TMA常见类型有演化TMA、预后TMA等。演化TMA指将某一肿瘤疾病发展的各个阶段的标本(诸如原发间变和继发胶母、原发胶母和复发胶母等)集中在一块TMA中，能在一张切片上同时看到肿瘤组织在原位、转移、复发等不同进展阶段的变化情况，可用以检测特定肿瘤在不同发展阶段的分子病理改变，有助于对肿瘤发生、发展及浸润转移等过程的研究。预后TMA是将带有可利用的临床随访数据的肿瘤标本集中在一张TMA中。使用预后TMA可以研究已知的分子靶标的改变或信号传导通路的变化对肿瘤患者预后的影响[2]。TMA阵列中每个组织片段都对应于相应患者，因此利用TMA，结合临床数据和随访资料，可以对肿瘤患者进行大规模的回顾性数据分析，为疾病的早期诊断、早期治疗等提供指导。文献报道利用预后TMA发现Cyclooxygenase-2对鼻咽癌患者放疗预后有预测价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，该方法使得检测BSP的表达的灵敏性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息。本专利技术的一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，包括:(I)使用Trizol试剂将脑组织进行总RNA的分离；(2)对步骤(I)得到的总RNA进行反转录，得到cDNA ；(3)将上述cDNA与SYBR荧光染料混合并进行扩增；(4)IBSP的表达通过抗GAPDH进行标准化，使用以下方程进行比较阈值循环法:表 =2~^Δ目标基因的ct值—Δ参照ct值).(5)构建组织芯片，然后进行免疫组化染色，对免疫组化结果进行统计分析，检测BSP在脑胶质瘤中的表达。步骤(I)中所述的脑组织为胶质瘤或正常脑组织。步骤(2)中所述的总RNA的质量为2ug,得到cDNA的质量为20ng。步骤(2)中所述的反转录为使用M-MLV反转录箱进行的。步骤(3)中所述的扩增为在CFX96实时探测系统中进行。步骤(3)中所述的扩增条件为42°C孵育60分钟，95°C孵育5分钟后冰上冷却。所用的引物为:IBSP，5’-AAAGTGAGAACGGGGAACCTR-3’正链，5’-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3’ 反链；GAPDH, 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ 正链，5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ 反链。在本专利技术中我们试图通过实时反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和组织芯片的免疫组化来检测BSP的表达，以研究BSP的表达和胶质瘤患者临床病理特征间的关系。我们的研究显示BSP在特定的胶质瘤组织中是高表达的，并且其高表达与肿瘤级别相关，预示了胶质瘤病人的预后不良。本专利技术利用高通量组织芯片进行脑胶质瘤预后方面的研究，制备的组织芯片属于预后TMA。进行的TMA制备总共包含300例脑胶质瘤标本和16例正常脑组织标本。300例胶质瘤标本中，星形细胞起源占78.1%，其他包括少突、室管膜、原始神经外胚层等起源占21.9% ;病理级别中，高级别胶质瘤占60.1%，GBM占39.5%。制备的脑胶质瘤组织芯片目前在国内样本量最大，随访周期较长，94%左右(284/300)的患者获得了详细的随访。脑胶质瘤组织芯片的制备为潜在性的脑胶质瘤靶标G0LPH3、BSP与胶质瘤预后相关性研究提供了坚实的基础。BSP通过何种分子机制促进肿瘤进展已在多项研究中有阐述。BSP可以与MMP2结合并调节其活性，从而激活MMP通路。 它还可加快增殖、侵袭以及癌细胞的转移。BSP也可以作为一个前血管生成因子通过与整合蛋白ανβ3结合促进血管生成。然而，BSP在胶质瘤发生和进展中的作用尚未知。胶质瘤患者血清中BSP的含量及其与预后和治疗反应的关系仍有待研究。血清BSP含量已被证明可用于预测乳腺癌的骨转移和生存以及前列腺癌的骨转移。研究血清BSP是否能作为一个便利的分子标记物来定义有肿瘤进展或预后不良风险的胶质瘤病人亚组是很有临床意义的。2级或3级的胶质瘤病人在复发时有可能向4级GBM进展(继发性GBM)。同样也有可能部分原发的GBM是在经过了一系列类似继发GBM的遗传学改变后才发生的，但在肿瘤发生前并没有引起临床的重视，直到其恶性进展为GBM发生才发现。目前为止还没有一个很好的方法能区分原发和继发的GBM，因为二者的组织病理改变还无法区分。我们使用实时RT-PCR和组织芯片的免疫组化方法检测了包含15例正常脑组织及270例胶质瘤样本中BSP的表达量。通过Kaplan-Meier方法计算累积生存并使用log-rank测试来分析。应用阶梯式前行Cox回归模型进行单因素及多因素分析。高级别胶质瘤样本中BSP无论在m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，包括：（1）使用Trizol试剂将脑组织进行总RNA的分离；（2）对步骤（1）得到的总RNA进行反转录，得到cDNA；（3）将上述cDNA与SYBR荧光染料混合并进行扩增；（4）IBSP的表达通过抗GAPDH进行标准化，使用以下方程进行比较阈值循环法：表达折叠差异=2?(Δ目标基因的ct值–Δ参照ct值)；（5）构建组织芯片，然后进行免疫组化染色，对免疫组化结果进行统计分析，检测BSP在脑胶质瘤中的表达。
【技术特征摘要】
1.种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，包括: (1)使用Trizol试剂将脑组织进行总RNA的分离； (2)对步骤(1)得到的总RNA进行反转录，得到cDNA； (3)将上述cDNA与SYBR荧光染料混合并进行扩增； (4)IBSP的表达通过抗GAPDH进行标准化，使用以下方程进行比较阈值循环法:表达折 =2 目标基因的ct值-Δ参照ct值).(5)构建组织芯片，然后进行免疫组化染色，对免疫组化结果进行统计分析，检测BSP在脑胶质瘤中的表达。2.据权利要求1所述的一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，其特征在于:步骤(1)中所述 的脑组织为胶质瘤或正常脑组织。3.据权利要求1所述的一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的总RNA的质量为2ug，得到cDNA的质量为20ng。4.据权利要求1所述的一种利...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈菊祥，徐涛，秦荣，卢亦成，严勇，周劲旭，王洪祥，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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