样品中腐败乳酸菌的PCR 检测方法技术

本发明专利技术提供了一种样品中腐败乳酸菌的PCR检测方法，该方法包括：腐败乳酸菌的超滤富集和液体培养增菌、煮沸-冻融法制备腐败乳酸菌的DNA模板、使用特异性引物通过聚合酶链式反应（PCR）对DNA模板进行扩增以及用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行可视化等步骤。本发明专利技术可以检测出啤酒或清酒等测定样品是否受到腐败乳酸菌的污染，检测时间短、检测结果特异性强和结果判定简便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种样品中腐败乳酸菌的PCR检测方法。
技术介绍
现代啤酒和清酒是由单一菌种酵母发酵而成的，但在酿造过程中，酿造设备、空气、酿造用水等诸多因素都有可能导致有害微生物进入麦汁或发酵液中，如果这些有害微生物大量生长繁殖，就会污染麦汁或酒体。污染腐败的细菌对啤酒和清酒的质量影响相当大，会造成啤酒和清酒总酸升高、高级醇升高、口味不协调、有杂异味、粘度增加、影响酵母正常生长与发酵、无菌滤膜堵塞等问题，轻者影响口味，重者造成酒体浑浊、沉淀，会给消费者和生产厂家造成伤害和损失。长期以来，啤酒和清酒污染菌检测一直采用传统的微生物检测方法:污染菌采用特定培养基并在厌氧环境下进行培养检出，这通常需要一周的时间，这对于啤酒和清酒生产企业来说是非常不利的。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，具有快速、灵敏、操作简单等优点，已广泛应用于医疗、食品和环境微生物的快速检测和鉴定中。但采用PCR对啤酒和清酒污染菌进行检测还未见相关报道。
技术实现思路
除非特别说明，本专利技术所用术语具有本专利技术所属
的一般含义。本专利技术的目的是开发一种样品中腐败乳酸菌的快速有效的PCR检测方法。本专利技术通过采用腐败乳酸菌的超滤富集和液体培养增菌、煮沸-冻融法制备腐败乳酸菌的DNA模板、使用特异性引物通过聚合酶链式反应(PCR)对DNA模板进行扩增以及用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行可视化等步骤，实现了上述目的。具体而言，本专利技术的样品中腐败乳酸菌的PCR检测方法包括以下步骤:(I)在无菌条件下用0.22 μ m水系超滤膜过滤样品，将腐败乳酸菌富集在超滤膜上；(2)将富集腐败乳酸菌的超滤膜放入装有MRS液体培养基的离心管中，密封，于28 32°C培养12 20h进行增菌； (3)将增菌后的离心管在800(Tl0000r/min离心3 5min收集菌体，用无菌水洗菌体，离心，然后用无菌水配制成600nm吸光值为0.Γθ.3的菌悬液，将菌悬液放入沸水浴中加热l(Tl5min，然后放入冰浴中冷却l(Tl5min，重复此加热和冷却步骤2 3遍，提取腐败乳酸菌DNA ；(4)使用针对腐败乳酸菌的抗酒花基因HorA设计的特异性引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，对腐败乳酸菌DNA中的抗酒花基因HorA进行PCR扩增；(5)在琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳；(6)根据电泳结果分析样品中是否存在腐败乳酸菌。上述样品一般为啤酒或清酒，腐败乳酸菌一般为乳酸杆菌、足球菌、微球菌、链球菌和明串珠菌中的至少一种。本专利技术的特异性引物可以采用本领域已知的设计原则，应用本领域已知的PCR引物设计软件(如DNAstar和Primer Premier5.0)来设计。设计时,优选采用设计软件推荐的或者默认的参数设置。本专利技术的特异性引物具体优选如下(由该套引物产生约0.5kb的扩增子):SEQ N0.1:5/ -ATGCAAGCTCAGTCCAAGAACAA-3'SEQ N0.2:5/ -TAATGATAGTCATCCGCCAGTCC-3'。此外，本专利技术中，步骤(4)中的PCR反应条件优选如下:腐败乳酸菌DNA2(T30ng，浓度I 3μΜ的引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2各:μ Μ，5 X PrimeSTAR聚合酶反应缓冲液3 8μ L，四种核苷酸每种浓度分别为2.5mmol/L的dNTPl 5y L，PrimeSTAR聚合酶0.1 0.3 μ L，加入灭菌水使总体积为10 30yL，置于PCR仪内，93 97°C 5 lOmin，90^95°C 45s 3min，45 55°C 45s 3min，70 75°C 50s 5min，进行 25 40 个循环，最后 70 75°C延伸5 20min，15 25°C结束反应。步骤(5)中使用的琼脂糖凝胶浓度一般为0.3^2.7wt9L酒花是啤酒或清酒中必不可少的成分，它赋予啤酒或清酒特有的清香风味，且具有防腐作用，酒花中的0-酸(律草酮)、0-酸(蛇麻酮)以及异α-酸(异律草酮)对革兰氏阳性菌具有抑制作用。啤酒或清 酒中的污染菌主要是一群包括乳酸杆菌、足球菌、微球菌、链球菌、明串珠菌等多个属的乳酸菌(本专利技术中称作“腐败乳酸菌”)。作为革兰氏阳性的腐败乳酸菌能够在啤酒或清酒中生长繁殖，源于它们具有酒花抗性，而酒花抗性的分子基础是其细胞内含有抗酒花基因HorA。HorA基因编码的多肽是一种ATP偶联的运输载体，可以将酒花化合物(Hop-H)分泌到胞外。它的作用机制是这样的:当酒花浓度升高时，诱导HorA基因过量表达，同时在胞内产生大量ATP，而这些ATP大大激发了 H+-ATP酶活性，使得高浓度的质子被排出到胞外，酒花化合物进入细胞，由于内部pH较高而将酒花化合物离解成阴离子和质子，酒花阴离子捕捉二价阳离子如Mn2+并扩散到胞外，从而避免了酒花化合物对细胞的伤害。HorA基因存在于腐败乳酸菌内的质粒上，能够在啤酒或清酒中生长的腐败乳酸菌都含有这种质粒。本专利技术采用针对腐败乳酸菌的HorA基因设计的特异性引物对HorA基因进行PCR扩增，该PCR扩增是特异性扩增，即能够有效地扩增腐败乳酸菌的HorA基因片段而基本上不扩增其它无关的基因片段，而且PCR分析不受来自酒体中蛋白质等背景因子的干扰，因此可以快速且特异地检测出啤酒或清酒等测定样品是否受到腐败乳酸菌的污染，本专利技术检测时间短、检测结果特异性强和结果判定简便。附图说明图1显示了啤酒腐败乳酸菌HorA基因的PCR扩增结果(琼脂糖凝胶电泳)。泳道M表示标准分子量Marker ;泳道I表示HorA基因的PCR扩增结果。图2显示了啤酒腐败乳酸菌和非啤酒腐败菌(此处的非啤酒腐败菌是指在啤酒中不能生长繁殖、不具有酒花抗性的腐败菌)HorA基因的PCR扩增结果(琼脂糖凝胶电泳)。泳道M表示标准分子量Marker ;泳道I和2表示戊糖乳杆菌ATCC8041 (来源于美国典型培养物保藏中心)HorA基因的PCR扩增结果；泳道3和4表示类布氏乳杆菌ATCC49374 (来源于美国典型培养物保藏中心)HorA基因的PCR扩增结果；泳道5和6表示非啤酒腐败菌嗜热链球菌ATCC19258 (来源于美国典型培养物保藏中心)的PCR扩增结果。图3显示了清酒和啤酒中腐败乳酸菌HorA基因的PCR扩增结果(琼脂糖凝胶电泳)。泳道M表示标准分子量Marker ;泳道I表示清酒中腐败乳酸菌HorA基因的PCR扩增结果；泳道2表示啤酒中腐败乳酸菌HorA基因的PCR扩增结果。具体实施例方式下面结合实施例 详细说明本专利技术，但下面的实施例仅为本专利技术较佳的实施方式，本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术披露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。实施例1:啤酒腐败乳酸杆菌HorA基因的扩增及其鉴定实验所用菌株是能引起啤酒腐败的戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)ATCC8041(来源于美国典型培养物保藏中心)。用无菌水制成波长600nm的吸光值为0.2的菌悬液。取0.5ml菌悬液，在沸水浴中加热lOmin，然后放入冰浴中冷却本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种样品中腐败乳酸菌的PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）在无菌条件下用0.22μm水系超滤膜过滤样品，将腐败乳酸菌富集在超滤膜上；（2）将富集腐败乳酸菌的超滤膜放入装有MRS液体培养基的离心管中，密封，于28~32℃培养12~20h进行增菌；（3）将增菌后的离心管在8000~10000r/min离心收集菌体，用无菌水洗菌体，离心，然后用无菌水配制成600nm吸光值为0.1~0.3的菌悬液，将菌悬液放入沸水浴中加热10~15min，然后放入冰浴中冷却10~15min，重复此加热和冷却步骤2~3遍，提取腐败乳酸菌DNA；（4）使用针对腐败乳酸菌的抗酒花基因HorA设计的特异性引物SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2，对腐败乳酸菌DNA中的抗酒花基因HorA进行PCR扩增；（5）在琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳；（6）根据电泳结果分析样品中是否存在腐败乳酸菌。

【技术特征摘要】
1.一种样品中腐败乳酸菌的PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)在无囷条件下用0.22 μ m水系超滤1旲过滤样品，将腐败乳Ife囷g集在超滤1旲上； (2)将富集腐败乳酸菌的超滤膜放入装有MRS液体培养基的离心管中，密封，于28 32°C培养12 20h进行增菌； (3)将增菌后的离心管在800(Tl0000r/min离心收集菌体，用无菌水洗菌体，离心，然后用无菌水配制成600nm吸光值为0.f 0.3的菌悬液，将菌悬液放入沸水浴中加热l(Tl5min，然后放入冰浴中冷却l(Tl5min，重复此加热和冷却步骤2 3遍，提取腐败乳酸菌DNA ； (4)使用针对腐败乳酸菌的抗酒花基因HorA设计的特异性引物SEQID N0.1和SEQ IDN0.2，对腐败乳酸菌DNA中的抗酒花基因HorA进行PCR扩增； (5)在琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳； (6)根据电泳结果分析样品中是否存在腐败乳酸菌。2.按权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于，所述样品为啤酒或清酒。3.按权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于，所述腐败乳酸菌为乳酸杆菌、足球菌、微球菌、链球菌和明串珠菌中的至少一种。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宪臻，李全，俞志敏，杨帆，王伟，蔡勇，郝庆山，高文举，
申请(专利权)人：大连工业大学，四平金士百纯生啤酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：