一种银杏酚酸的生物降解方法技术

一种银杏酚酸的生物降解方法，利用漆酶LacC，按比例，当降解体系中含有一定浓度的银杏酚酸，添加漆酶LacC的浓度为0.004U/mL-0.006U/mL，降解体系的pH4.0-6.0，降解温度为45℃～60℃，降解处理时间为10～24小时。单纯的用漆酶对银杏酚酸进行降解，其降解效率不到30%，加入介体物质后，特别是加入ABTS后，其降解效率最高可达100%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术旨在建立一种漆酶生物降解银杏酚酸的方法，涉及到酶工程及食品领域。
技术介绍
银杏叶提取物(EGB)的主要成分为黄酮和内酯类化合物，具有抗氧化、抗血小板激活因子(PAF)作用和拮抗PAF特异性受体作用。大量的药理分析和临床实验证实，银杏叶提取物对冠心病、高血压、心绞痛、动脉硬化、脑功能减退、老年性痴呆、老年性记忆减退、衰老等与心脑血管循环有关的疾病都有显著的预防和治疗效果。银杏叶提取物广泛用于医药、保健品、食品与化妆品中，德、法等国每年从东亚几个国家(主要是韩国、中国)大量进口银杏叶，作为制药原料，成品销售全世界。但银杏酚酸存在于银杏外种皮、银杏叶和银杏果中，在外种皮中含量最高。其结构可看作是水杨酸分子在苯环C6位上有较长侧链的系列化合物，该长链分烷基和烯基两大类，一般由13-17个碳原子组成，属细胞毒素，可能与诱导机体突变和致癌有关，能引起皮肤、粘膜等处的过敏性炎症反应。因此，银杏酚酸(Ginkgolic acids)是银杏叶提取物中关键的限量指标。但在提取银杏叶黄酮和内酯类化合物等活性物质过程中，银杏酚酸也会同时被浸提出来。其含量随提取工艺、纯化工艺不同而不同。但国内绝大部分银杏叶提取物中银杏酚酸严重超标，严重危害着人们的健康。目前，国际上对银杏叶提取物中银杏酚酸含量的严格控制，促进了人们对选择性脱除银杏酚酸类物质的研究力度。目前，所报导的方法主要是改进提取工艺、强化提纯环节。无疑降低了活性物质的得率，增加了制备成本。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，该酶在白腐菌中普遍存在，少数低等真菌和植物中也产生，多为分泌型糖蛋白。由于漆酶是一种氧化还原酶，其作用主要是催化氧化还原反应，能够催化很多酚型化合物的氧化反应，但由于其氧化还原电势较低，对非酚类结构化合物却不能够直接氧化降解，或对许多酚型化合物降解效率不高。若在某些小分子氧化还原介质帮助下，漆酶作用的底物范围可进一步扩大，能够氧化非酚型的有机化合物，也能够显著地提高酚型化合物的降解效率。漆酶氧化还原介质系统(LMS)是指漆酶在介体和氧的存在下进行生物催化的过程。介体在酶的作用下会形成活性高且有一定稳定性的中间体，这些活性中间体能从氧分子中获得电子传递给底物，从而使底物降解。漆酶/氧化还原介质系统作为一种具有很大潜在应用价值的体系越来越受到国内外的关注。鉴于国内绝大部分银杏叶提取物中银杏酚酸严重超标，严重危害着人们的健康。目前，所报导的方法主要是改进提取工艺、强化提纯环节。不仅降低了活性物质的得率，增加了制备成本，而且效果不够明显，难以达到国际上对银杏叶提取物中银杏酚酸含量的限量标准。且到目前为止，利用漆酶或漆酶介质系统对银杏酚酸进行生物降解在国内外还未见研究报道。
技术实现思路
解决的技术问题本专利技术的目的是建立一种生物降解银杏酚酸的方法，旨在将一些银杏制品在经过漆酶降解后有效地除去银杏酚酸。技术方案，利用漆酶LacC，降解体系中漆酶LacC的浓度为0.004U/mL-0. 006U/mL,降解体系的pH4. 0-6. 0，降解温度为45°C 60°C，降解处理时间为10 24小时。降解体系中添加有终浓度0.1 ImM的2，2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)U-羟基苯并三唑(HOBT)、紫脲酸(VA)或愈创木酚。所述漆酶LacC由下述方法制得培养栓菌(Trametes versicolor),培养基为麸皮20g/L,葡萄糖5g/L,酒石酸铵120mmol/L, 200mmol/L pH 5. 0朽1檬酸缓冲液，Immol/L愈创木酚，0.1mL Tween 80，0. 3mmol/L Cu2+，培养条件为28°C培养5d ;将IL培养好发酵液置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心IOmin收集上清液即为漆酶粗酶液；然后在上清液中加入终浓度为80%wt 的硫酸铵，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心30min,沉淀用20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer溶解透析；透析处理过的酶液进行 DEAES印harose CL-6B 离子交换柱层析，采用平衡液20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer,洗脱缓冲液20mM pH 7. OTris-HCl buffer，NaCl的浓度梯度为0-0. 6mol/L，洗脱体积为800mL，洗脱速度1. 5mL/min，每4mL收集一管检测漆酶活性，通过蛋白检测仪检测到三个蛋白峰，最后一个峰所收集的为漆酶LacC。所述漆酶LacC也可以由下述方法制得(I)栓菌(Trametes versicolor)的培养培养基为PDA :葡萄糖20g/L,马铃薯汁20%wt,接种新鲜的栓菌菌丝，28°C下180rpm培养3_4天过滤收集菌丝体；(2)栓菌总RNA的提取取收集的栓菌的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗后，在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中,加入ImL Trizol后剧烈震荡，4°C下12000g离心IOmin后转移上清液至2mL离心管，加入200 ii L氯仿震荡15s混匀后30°C下孵育2-3min，4°C下12000g离心IOmin取上层清夜，加入上清液0. 8倍体积的异丙醇混匀后4°C下12000g离心lOmin，去净上清后用75%wt乙醇水溶液清洗2次后4°C下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作为模板RNA，-20°C下保存；(3)栓菌cDNA的合成以栓菌总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液50 u M Oligo dTIuL,IOmM dNTP Mixture IuL,总RNAlug,DEPC-H2O7uL；混勻后6515C下保温5min后冰上放置Imin ；在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液上述RNA/Primer 混合液10 u L,5 X PrimeScript Buffer4 u L,40U/ u L RNase Inhibiter0. 5 u L,200U/ u L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 U L;上述反应液混匀后在50°C下保温lh，70°C下保温15min后冰上冷却，得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成；(4)栓菌基因的克隆设计LacC引物，载体为pPICZaB :P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA ；P10:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA ；基因LacC的克隆利用引物P9和P10，反应条件为94 °C，5min ;暂停计时，加ExTaq 聚合酶，加 40iiL 石蜡油密封；30 次循环(94°C，30s ；58°C,30s ；72°C,90s) ；72°C,IOmin ;反应停止，4°C保温；得到基因LacC，用EcoR I，Xba I酶切，同时表达载体也用相同的酶分别酶切，基因LacC和酶切后的载体分别连接过夜，转化大肠杆菌，得到重组质粒pPICZa B-LacC；(5)重组漆酶LacC的制备将重组质粒pPICZ a B-LacC线性化后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于利用漆酶LacC，降解体系中漆酶LacC的浓度为0.004U/mL?0.006U/mL，降解体系的pH4.0?6.0，降解温度为45℃～60℃，降解处理时间为10～24小时。

【技术特征摘要】
1.一种银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于利用漆酶LacC，降解体系中漆酶LacC的浓度为O. 004U/mL-0. 006U/mL,降解体系的pH4. 0-6. O,降解温度为45°C 60°C，降解处理时间为10 24小时。2.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于降解体系中添加有终浓度O.1 ImM的2，2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑_6_磺酸)二铵盐(ABTS)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、紫脲酸(VA)或愈创木酚。3.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述漆酶LacC由下述方法制得培养栓菌(Trametes versicolor),培养基为麸皮20g/L,葡萄糖5g/L,酒石酸铵 120mmol/L, 200mmol/L pH 5. O 朽1 樣酸缓冲液，lmmol/L 愈创木酌·, O.1mL Tween.80,0. 3mmol/LCu2+，培养条件为28°C培养5d ;将IL培养好发酵液置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心IOmin收集上清液即为漆酶粗酶液；然后在上清液中加入终浓度为.80%wt的硫酸铵，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心30min，沉淀用20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer溶解透析；透析处理过的酶液进行DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析，采用平衡液20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer，洗脱缓冲液20mMpH 7. OTris-HCl buffer, NaCl的浓度梯度为0-0. 6mol/L，洗脱体积为800mL，洗脱速度.1.5mL/min，每4mL收集一管检测漆酶活性，通过蛋白检测仪检测到三个蛋白峰，最后一个峰所收集的为漆酶LacC。4.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述漆酶LacC也可以由下述方法制得 (1)栓菌(Trametesversicolor)的培养培养基为PDA :葡萄糖20g/L,马铃薯汁.20%wt,接种新鲜的栓菌菌丝，28°C下180rpm培养3_4天过滤收集菌丝体； (2)栓菌总RNA的提取取收集的栓菌的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗后，在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中，加入ImL Trizol后剧烈震荡，4°C下12000g离心IOmin后转移上清液至2mL离心管，加入200 μ L氯仿震荡15s混匀后30°C下孵育2_3min，.4°C下12000g离心IOmin取上层清夜，加入上清液0. 8倍体积的异丙醇混匀后4°C下12000g离心lOmin，去净上清后用75%wt乙醇水溶液清洗2次后4°C下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作为模板RNA，-20°C下保存； (3)栓菌cDNA的合成以栓菌总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链 在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液 .50 μ M Oligo dTI μ L, IOmM dNTP Mixture I μ L, 总 RNAI μ g， DEPC-H2O7 μ L ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵林果，孙伟，曹福亮，姜艳，汪贵斌，郑璐，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：