蛋白质纯化制造技术

本发明专利技术涉及从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其包括第一阳离子交换色谱步骤及第二阴离子交换色谱步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质纯化专利
本专利技术为蛋白质纯化领域。更具体地，其涉及用于纯化抗体片段的方法。专利技术背景对蛋白质进行大规模的经济型纯化已经成为生物技术工业中越来越重要的问题。 通常，蛋白质是由细胞培养物生产的，使用的是通过插入含有编码所述蛋白质的基因的重组质粒而工程改造为生产目的蛋白质的哺乳动物或细菌细胞系。由于所使用的细胞系为活的生物体，所以其必须以复杂的生长基质进行饲养，所述生长基质含有糖类、氨基酸，以及生长因子。必须将目的蛋白质从饲养给细胞的化合物的混合物中及从细胞自身的副产物 (原料流)中分离出来以达到可足够用于人类治疗剂的纯度。卫生当局对用于人类施用的蛋白质中原料流的杂质设立的标准非常高。本领域已知的许多用于蛋白质的纯化方法包括的步骤要求应用例如低或高pH、高盐浓度或其他可能不可逆地损害要纯化的蛋白质的生物学活性的极端条件，因此并不适合。所以，分离所需蛋白质达到足够的纯度提出了艰难的挑战。在历史上，认为蛋白质纯化方案是基于分子特性如大小、电荷及溶解性在要纯化的蛋白质与不期望的蛋白质污染物之间的差异。基于这些参数的操作流程包括大小排阻色谱、离子交换色谱、差异沉淀等等。抗体及抗体片段在广泛的治疗领域中越来越重要。生产抗体、抗体片段的最重要的 方法之一是通过重组技术。这些技术使用宿主细胞表达所需的抗体或抗体片段，然后将其从生产基质中分离并进行纯化。抗体需要进行糖基化，因此通常使用真核细胞在真核表达系统中表达，特别为哺乳动物细胞如CHO、PER. C6、NSO, BHK或Sp2/0细胞。在真核表达系统中，表达的目的蛋白质如抗体通常可分泌入细胞培养基质中。随后可容易地将基质与分泌蛋白质的细胞分离， 例如通过离心或过滤。几乎所有目前的工业抗体纯化平台都使用了蛋白质A(例如在W098/23645中有所描述)。蛋白质A为在金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)这种细菌的细胞壁中发现的细胞表面蛋白质，其结合哺乳动物免疫球蛋白的Fe部分。蛋白质A对人IgG1和IgG2 有高亲和性，而对人IgM、IgA和IgE抗体具有中等的亲和性。因此，蛋白质A纯化不能很好地适合缺乏Fe部分的抗体片段。不需要糖基化的蛋白质优选地是采用原核细胞如革兰氏阴性细菌在原核表达系统中表达的。特别地，不需要糖基化的抗体例如抗体片段如Fab、Fab’或scFv优选地在这种系统中表达。原核表达系统特别为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(大肠杆菌(E. coli))系统或其他革兰氏阴性细菌允许以有经济吸引力的方式制造不需要糖基化的蛋白质，例如抗体片段。在大肠杆菌中制造蛋白质是有益的，特别是因为物资成本较低，而药物开发进程更快(Humphreys, 2003; Humphreys, 2003)。原核表达系统,特别为大肠杆菌蛋白质表达系统在本领域已熟知(Swartz, 2001; Jana和Deb, 2005; Terpe, 2006)。原核细胞不会活性地分泌所述细胞中表达的异源目的蛋白质。然而可将革兰氏阴性原核细胞如大肠杆菌工程改造为异源蛋白质如抗体片段在细胞中表达并运出进入周质空间，在其中其能形成二硫键。将这些异源蛋白质从周质空间分离需要破坏原核细胞的外膜，这导致宿主蛋白质 (HCP)也基本上释放出来。用于破坏革兰氏阴性原核细胞的外膜并随后收获含有异源蛋白质的细胞培养液的方法在本领域已熟知。在大肠杆菌中制造抗体片段还导致副产物如截短的轻链、轻链的谷胱甘肽添加物及轻链二聚体的产生(Battersby等人，2001)。从原核表达系统如大肠杆菌表达系统中收获的细胞培养液(原料流)，特别是来自革兰氏阴性细菌的周质细胞提取物与收获自真核表达系统的细胞培养液在HCP的相对量和组合、需要与表达于所述原核或真核表达系统中的目的异源蛋白质分离的细菌DNA和内毒素上有本质的差异。HCP的浓度及HCP的复杂度和异质性取决于表达系统或细胞系及细胞培养条件(Arunakumari, 2009)。表达于原核表达系统特别为革兰氏阴性原核表达系统的抗体片段的纯化因此面对着不同的一组挑战并需要不同的手段(Humphreys和 Glover, 2001)。单克隆抗体片段的纯化的基本原则在本领域已知(Spitali，2009)。目前有两种由美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)批准的包含抗体片段作为活性成分的医疗产品，所述抗体片段是在微生物细胞中生产的妥珠单抗(certolizumabpegol Γ Imzia li )包含了特异性结合TNF α的Fab,而雷珠单抗(ranibizumab,Lucentis * )为特异性结合血管内皮生长因子(vegf)的Fab片段。妥珠单抗从微生物原料流中的纯化是使用四步色谱的方法进行的(Walsh，2007)。医疗产品阿昔单抗 (abciximab, ReoFro)包括嵌合人_小鼠单克隆抗体7E3的Fab片段，其结合人血小板的糖蛋白(GP) Ilb/IIIa受体并抑制血小板聚集。所述嵌合7E3抗体是通过在哺乳动物细胞培养物中进行连续灌注生产的。在用木瓜蛋白酶和柱色谱后从纯化的全长抗体中获得48Kd 的Fab片段。亲和色谱是基于目的蛋白质(或一组蛋白质)与偶联于色谱基质的特异配体之间的可逆的相互作用分离蛋白质的。目的蛋白质与偶联于色谱基质的特异配体之间的相互作用可为静电或疏水相互作用、范德华力和/或氢键键合的结果。为从亲和基质中洗脱靶标分子，所述相互 作用可被逆转，是特异性地使用竞争性配体或非特异性地通过改变pH、离子强度或剂型。亲和纯化需要能共价连接于色谱基质的生物特异性配体。偶联配体必须保留其特异性结合靶标分子的亲和性，且在洗涤去未结合材料后，配体和靶标分子之间的结合必须被逆转以使靶标分子以活性形式移除。尽管通常都会使用，但是亲和色谱很昂贵，尤其是在要纯化治疗性蛋白质的工业规模上。离子交换色谱可用于纯化可电离分子。离子化分子是基于其带电基团与连接于固相支持介质的带相反电荷的分子之间的非特异性静电相互作用，由此滞留了与固相相互作用更强的离子化分子而分离的。每种类型的离子化分子的净电荷及其对基质的亲和性根据带电基团数、每种基团的电荷以及竞争与带电固相基质相互作用的分子性质而变化。这些差异使得离子交换色谱能分辨多种分子类型。结合于固相的分子的洗脱通常是通过增加缓冲液的离子强度(即，电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带电位点而实现。改变pH并由此改变溶质电荷是另一种实现溶质洗脱的方式。电导率或PH的变化可为渐变(梯度洗脱) 或逐步的(分步洗脱)。已知的有两种常见的相互作用类型由带负电氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)侧链介导的阴离子交换色谱，其与带正电的表面相互作用，以及由带正电氨基酸残基(如赖氨酸和精氨酸)介导的阳离子交换色谱，其与带负电的表面相互作用。可将阴离子交换柱分类为弱或强。在弱的阴离子交换柱上的带电基团为弱碱，其会去质子化并因此在搞PH下丢失其电荷。二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素是一个弱阴离子交换剂的实例，其中氨基基团可在ρΗ 9下带正电，而在较高pH值下逐渐丢失其电荷。DEAE或二乙基-(2-羟-丙基)胺乙基(QAE)具有例如氯离子作为反荷离子。通过增加洗脱缓冲液的离子强度(洗脱色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.27 GB 1012603.51.用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其包括 a)第一色谱步骤以捕获抗体片段，其中含有抗体片段浓度为至少1.5g/L的混合物进行阳离子交换色谱并随后洗脱以产生含有所述抗体片段的第一洗脱物；以及 b)第二色谱步骤，其中第一洗脱物进行阴离子交换色谱以捕获杂质并产生含有抗体片段的流出液。2.根据权利要求1的方法，其中的方法包含不超过两个色谱步骤。3.用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其基本上由以下步骤构成 a)第一色谱步骤以捕获抗体片段，其中含有抗体片段浓度为至少1.5g/L的混合物进行阳离子交换色谱并随后洗脱以产生含有所述抗体片段的第一洗脱物 b)对第一洗脱物进行的第一次超滤； c)第二色谱步骤，其中纯化的第一洗脱物进行阴离子交换色谱以捕获杂质并产生含有抗体片段的流出液；以及 d)对流出液进行的第二次超滤。4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中所有色谱步骤都是在色谱柱上进行的。5.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中阳离子交换色谱是以洗脱模式进行的。6.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中第一阳离子色谱步骤按顺序包含以下步骤 a)将含有抗体片段的混合物如周质细胞提取物加样至阳离子交换柱， b)用洗涤缓冲液洗涤阳离子交换柱，其中在洗涤期间缓冲液的导电率、pH和盐浓度基本上保持不变，以及 c)用洗脱缓冲液洗脱抗体片段。7.根据权利要求6的方法，其中在第一色谱步骤之前，洗涤缓冲液的pH与含有抗体片段的混合物的PH相同。8.根据权利要求6或7的方法，其中含有抗体片段的混合物在第一色谱步骤前具有的pH 为 4. 0-5. O。9.根据权利要求1-8中任何一项的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·斯皮塔利，J·西蒙斯，R·怀特康比，M·R·皮尔斯黑金斯，
申请(专利权)人：UCB医药有限公司，
类型：
国别省市：