新型DNA-结合蛋白及其用途制造技术

本文公开了多肽、编码多核苷酸、包含新型DNA-结合结构域的细胞和生物，该新型DNA-结合结构域包括TALE?DNA-结合结构域。也公开了使用这些新型DNA-结合结构域用于调节内源性细胞序列的基因表达和/或基因组编辑的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供使用工程化DNA结合蛋白用于内源性基因和其他基因组基因座的基因修饰以及表达状态的调节的方法。
技术介绍
许多、可能大部分的生理和病理生理过程可通过选择性上调或下调节基因表达来控制。通过选择性调节可控制的病理学的例子包括在类风湿性关节炎中促炎细胞因子的不恰当表达、在高胆固醇血症中肝LDL受体的低表达、在实体瘤生长中促进血管新生因子的过表达以及抗血管生成因子的低表达，仅示出几个例子。此外，诸如病毒、细菌、真菌和原生动物的病原生物可通过改变它们的宿主细胞的基因表达来控制。因此，对于能够简单上调有益基因和下调导致疾病基因的治疗途径的需求明显尚未满足。此外，使得可选择性过表达和低表达选择的基因的简单方法在科学界具有巨大用途。使得可在细胞模型体系、转基因动物和转基因植物中调节基因的方法可广泛用于学术实验室、制药公司、基因公司以及生物
通常通过改变称为转录因子的序列特异性DNA结合蛋白的功能来控制基因表达。它们用于影响在启动子处转录起始复合物的形成或功能的效果。转录因子可以积极方式(激活)或消极方式(抑制)作用。转录因子功能可以为构成性(总是“作用”)或者条件性。可通过各种方式来赋予转录因子条件性功能，但是大量这些调控机制依赖于在细胞质中因子的隔绝，以及诱导性释放和随后核转位、DNA结合和激活(或者抑制)。以这种方式作用的转录因子的例子包括孕酮受体、固醇应答元件结合蛋白(SREBP)和NF-K B。有通过改变转录因子结合它们同源DNA识别序列的能力来应答磷酸化或小分子配体的转录因子的例子(Hou等,Science 256 1701 (1994) ；Gossen&Bujard, Proc.Nat，I Acad Sci 89:5547(1992) ；01igino 等，GeneTher. 5 :491-496(1998) ；ffang 等，Gene Ther. 4 :432-441(1997) ；Neering 等，Blood88 1147-1155(1996);以及 Rendahl 等，Nat. Biotechnol. 16 :757-761 (1998))。包含来自锌指蛋白("ZFP")的DNA结合结构域的重组转录因子具有调节内源性基因的基因表达的能力(参见，例如美国No. 6，534，261 ;6，599，692 ;6，503，717 ；6，689，558 ;7，067，317 ；7, 262, 054) 0使用这些包含工程化转录因子的锌指蛋白的临床试验已经显示这些新型转录因子能够治疗各种病症。(参见，例如Yu等(2006)FASEB J. 20 479-481)。在基因组生物学、特别是关于测定大量基因组中完整核苷酸序列中另一主要目标区是基因组序列的靶向改变。这些靶向切割活动可用于例如诱导细胞DNA序列的靶向诱变、诱导靶向缺失，以及促进在预定染色体基因座处靶向重组。参见，例如，美国专利公开 20030232410 ；20050208489 ；20050026157 ；20050064474 ；20060188987 ；2008015996 ；以及国际公开WO 2007/014275，其公开内容以引用方式整体并入以用于所有目的。也参见 Santiago 等(2008)Proc Natl AcadSci USA 105 :5809-5814 ;Perez 等(2008)NatBiotechnol 26:808-816(2008)。已将连接核酸酶的切割结构域至设计的DNA-结合蛋白(例如，连接至来自诸如FokI的核酸酶切割结构域的锌指蛋白(ZFP))的人工核酸酶用于在真核细胞中靶向切割。例如，已经显示，锌指核酸酶-介导的基因组编辑修饰在特定位置处人基因组的序列，通过(I)在期望修饰的靶位点处特异性产生在活细胞的基因组中双链断裂(DSB);以及通过(2)使得可以天然机制来DNA修复以“治愈”该断裂。 为了增加特异性，使用在结合DNA时二聚化的一对或多对定制设计的锌指核酸酶来诱导切割活动以形成催化活性核酸酶复合物。此外，通过使用包括工程化切割半结构域的一对或多对锌指核酸酶来进一步增加特异性，该工程化切割半结构域仅在形成异源二聚体时切割双链DNA。参见，例如美国专利公开No. 20080131962，其以引用方式整体并入本文中。通过人工核酸酶产生的双链断裂(DSB)已经用于例如诱导细胞DNA序列的靶向诱变、诱导靶向缺失；以及促进在预定染色体基因座处靶向重组。参见，例如，美国专利公开 20030232410 ；20050208489 ；20050026157 ；20050064474 ；20060188987 ；20060063231 ；20070218528 ；20070134796 ;20080015164 和国际公开 No. WO 07/014275 以及TO2007/139982，其公开内容以引用方式整体并入以用于所有目的。因此，在靶基因组位置处产生DSB的能力使得可基因组编辑任何基因组。存在修复DSB-同源重组和非同源末端接合(NHEJ)的两个主要和不同的途径。同源重组需要作为模板(称为“供体”)的同源序列的存在以引导细胞修复过程，并且修复的结果是无误差的和可预测的。在缺乏同源重组的模板(或“供体”)序列下，细胞通常尝试通过NHEJ的易错过程来修复DSB。已知黄单胞菌属(Xanthomonas)的植物致病细菌导致在重要作物中许多疾病。黄单胞菌属的致病性依赖于保守III型分泌(T3S)系统，其注入多于25种不同的效应物蛋白至植物细胞内。其中注入的蛋白为转录激活因子样效应物(“TALE”或“TAL-效应物”)，该转录激活因子样效应物模拟植物转录激活因子以及操纵植物转录组(参见Kay等(2007) Science 318:648-651)。这些蛋白包含DNA结合结构域以及转录激活结构域。最良好表征的TALE之一是来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestrispv. Vesicatoria)的 AvrBs3 (参见 Bonas 等(1989) Mol Gen Genet 218 127-136 以及W02010079430)。TALE包含介导DNA识别的集中重复结构域，其各重复单元包含指定一个靶碱基的约33-35个氨基酸。TALE也包含核定位序列和多个酸性转录激活结构域(关于概述参见 Schornack S，等(2006) J PlantPhysiol 163(3) :256-272)。此外，在植物致病细菌青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的两个基因中，已经发现,指定的brgll和hpxl7与在青枯雷尔氏菌生物变型I菌株GMI1000和在生物变型4菌株RS1000中黄单胞菌属的 AvrBs3 家族同源(参见Heuer 等(2007) Appl and Envir Micro 73(13) :4379-4384)。这些基因的核苷酸序列彼此具有98.9%同一性，但是区别在于在1^117的重复结构域中I,575bp的缺失。然而，两基因产物与黄单胞菌属的AvrBs3家族蛋白具有小于40%序列同一性。这些TALE的DNA-结合特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·D·格雷戈里，J·C·米勒，D·帕斯乔恩，E·J·瑞巴，S·谭，F·诺弗，L·张，
申请(专利权)人：桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：
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