本发明专利技术公开了一种复合纳米材料检测肿瘤标志物的纸芯片电化学发光免疫传感器的研究及应用的方法。纸芯片和传感器制备方法（示意图见附图）,主要包括以下步骤：在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热；制备出石墨烯-金属复合纳米材料和量子点-多孔硅纳米材料；将纳米材料修饰到纸芯片，将抗体接到纳米材料修饰的纸芯片上；与抗原特异识别后，发光材料标记的抗体与抗原特异识别，制作电化学发光免疫传感器；处理好的纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电化学发光信号。本发明专利技术检测特异性强，灵敏度高，可以达到ng级；诊断监测速度快，完成一个基本检测过程所需时间较短；该传感器底端的胶片电极可以多次反复使用，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及复合纳米材料技术、纸芯片技术和肿瘤标志物检测
，更具体地说是一种应用复合纳米材料借助于纸芯片来检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器。
技术介绍
肿瘤是人类健康的杀手。恶性肿瘤也称癌症，是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，它是机体受各种内在或外在致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失掉了对其自身生长的正常调控，导致不正常增生而形成的新生物。肿瘤的发生是一个长期的、多阶段的、多基因改变累积过程，具有多因素调节和多基因控制的复杂性。肿瘤发病率和死亡率的上升趋势直接威胁着人类健康，它的早期诊断和治疗是肿瘤防治研究的重要前言领域之一。免疫分析法是利用抗体与抗原特异性结合而建立的高选择性生物化学方法。用免疫细胞化学方法来检测和定位肿瘤细胞所特有的肿瘤标记，已经越来越引起广大肿瘤病理学研究工作者的兴趣。现在有许多免疫组织化学方法可用于组织细胞的定性和定量分析以及成分检测。目前，主要的免疫分析方法有电化学免疫分析、化学发光免疫分析、流动注射化学发光免疫分析、高效液相色谱化学发光免疫分析、毛细管电泳化学发光免疫分析等，但是这些检测方法在某些方面还存在不足，因此急需一种新的灵敏的检测方法。为适应临床诊断和即时检测的要求，实验室芯片应运而生，实验室芯片的重要性和应用性已被广泛认知，现在的芯片研究主要集中于材料的易得、价廉、易于修饰、易于储存和运输，而纸芯片很好地体现了这些优势。有很多经济实用的构建纸芯片的方法已被应用，其中打印是最经济，并最容易进行大量生产的方式之一，而打印中最省时有效的构建纸传感器的则是蜡打印。纸芯片传感器可借助多种方法来检测，其中电化学发光免疫传感器之所以引起公众极大的兴趣是由于此法综合了电化学分析和化学发光的高选择性、高灵敏度、需样量少等优点。电化学发光涉及到的丝网印刷电极的生产及使用技术也已有报道。此夕卜，纸上电化学发光呈现出了较好的运行结果；纤维素纤维没有任何扩散阻碍，反而，黏贴在电极表面的浸透的芯片使检测更不易受震动和其它对流的影响。为了进一步提高纸上电化学发光方法的灵敏度，在这里我们采用了复合纳米材料来增大检测信号。我们熟知石墨烯导电性较好，经研究发现金属掺杂后的石墨烯导电性又得到了很大的提高，因此我们的设计是将石墨烯-金属复合纳米材料修饰于工作电极上用来固定一抗可以更好的促进电子传递，从而增大电化学发光信号。另一方面，可以借助于多孔硅纳米材料的较大的比表面积和好的生物相容性，将CdTe量子点发光试剂接到多孔硅上得到量子点-多孔硅复合纳米材料，并将其标记在二抗上，这样可以实现发光信号的多倍放大效果。本文第一次在使用石墨烯-金属和量子点-多孔硅的基础上将纸芯片与电化学发光相结合。将蜡打印纸芯片与丝网印刷电极相结合，构建低成本、一次性使用的复合纳米材料电化学发光纸芯片传感器。此类传感器通过石墨烯-金属修饰的纸芯片来捕获抗体，量子点-多孔硅来标记二抗，石墨烯-金属用于加速电子转移速率，量子点-多孔硅用于放大信号，从而可以提高传感器的灵敏度。用几种抗原作为实例分析物，超灵敏免疫传感器展现了极好的分析性能。这种简单、经济、线性范围广、重现性好、灵敏度高的免疫传感器在临床检测不同的肿瘤标志物方面有很好的发展前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供了一种应用复合纳米材料的诊断监测速度快、灵敏度高、特异性强、现场体外即时诊断监测的纸芯片免疫传感器的制备及检测方法，此方法可以在绝大多数实验室中轻易实现而不需要复杂繁琐的大型设备支持。本专利技术用石墨烯-金属和量子点-多孔硅复合纳米材料纸芯片免疫传感器的制造方法，其特征包括以下步骤 (1)在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热，目的是将蜡烤化并使其均匀的渗透到色谱纸的内部，从而在未印蜡的部位形成亲水通道； (2)选择临床发病率较高的肿瘤标志物进行测定； (3)利用纳米材料，制备出石墨烯-金属复合纳米材料； (4)制备出量子点-多孔硅复合纳米材料，并用于标记二抗； (5)将石墨烯-金属复合纳米材料修饰于处理后的纸芯片通道上，用以提高纸芯片的导电性，提高其灵敏度； (6)在步骤(5)之后修饰用于捕捉抗体的硫堇； (7)利用抗原-抗体特异性识别和组装表面修饰技术等，将量子点-多孔硅复合材料标记的二抗修饰到步骤(6)之后的纸芯片表面上，制作电化学发光传感器。(8)处理好的纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电化学发光信号； (9 )丝网印刷电极在使用前需要用抛光粉打磨光滑，备用。本专利技术所述使用石墨烯-金属复合纳米材料可以为石墨烯-Cu、石墨烯-Co，石墨烯-Pt。本专利技术所述使用量子点-多孔硅纳米材料可以为CdTe量子点-多孔硅纳米材料。本专利技术所述肿瘤标志物为甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原、癌胚铁蛋白、胰癌胚抗原、细胞角蛋白、鳞癌相关抗原、前列腺特异性抗原(PSA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、CEA、CA 19-9, SCC、CA 15-3, CA 12-5, HCG、F-PSA, PAP、TMA、人绒毛膜促性腺激素(hCG )、」L茶酚胺类物质。附图说明图1. a—微流控纸芯片免疫修饰过程的区域； b—对应a的一个工作电极； c一银/氯化银参比电极； d—石墨对电极； e—聚酰胺纤维胶片； 图2.⑴一图1中的纸芯片的a区域；(2)—在a区域中先修饰石墨烯-金属后的示意 (3)—在步骤(2)后再修饰硫堇和戊二醛； (4)一在步骤(3)后，捕获与抗原相应的抗体； (5)—用牛血清白蛋白封闭可能结合抗原的位点； (6)—抗体捕获相应的抗原； (7)—用量子点-多孔硅标记的抗体与抗原结合。本专利技术所述肿瘤标志物为甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原、癌胚铁蛋白、胰癌胚抗原、细胞角蛋白、鳞癌相关抗原、前列腺特异性抗原(PSA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、 神经元特异性烯醇化酶(NSE)、CEA、CA 19-9, SCC、CA 15-3, CA 12-5, HCG、F-PSA, PAP、TMA、人绒毛膜促性腺激素(hCG )、」L茶酚胺类物质。一种快速检测肿瘤标志物的方法，其特征是包括如下步骤将按上述方法制得的应用复合纳米材料的纸芯片电化学发光免疫传感器配合电化学发光仪，对肿瘤标志物进行检测。实施例1 (胚胎抗原类，如甲胎蛋白，AFP) 一种应用复合纳米材料检测AFP的纸芯片电化学发光免疫传感器制备方法，包括以下步骤 (1)选择临床发病较高的AFP进行测定； (2)制备电极检测装置设计双电极丝网印刷模板，用丝网印刷机或手工印刷石墨电极和银氯化银电极，并打磨光滑备用。设计与胶片电极模型对应的纸芯片，用蜡印机打印出设计的图案，并烘烤至蜡渗透纸芯片，制备吸水的工作区域， (3)石墨烯-Cu复合纳米材料制备'2mL氧化石墨烯溶解在100 mL水中超声Ih得到氧化石墨烯的水溶液，向溶液中加入溶解有2. 5 g CuSO4 ·5Η20和O. 8 g EDTA · 2Na -H2O的20 mL水溶液，超声10分钟。然后，2. 24 g KOH和O. 27 g KBH4的20 mL水溶液缓慢加入以上得到的溶液，该溶液搅拌3本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术用石墨烯?金属和量子点?多孔硅复合纳米材料纸芯片电化学发光免疫传感器的制造方法，其特征包括以下步骤：（1）在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热，目的是将蜡烤化并使其均匀的渗透到色谱纸的内部，从而在未印蜡的部位形成亲水通道；（2）选择临床发病率较高的肿瘤标志物进行测定；（3）利用纳米材料，制备出石墨烯?金属复合纳米材料；（4）制备出量子点?多孔硅复合纳米材料，并用于标记二抗；（5）将石墨烯?金属复合纳米材料修饰于处理后的纸芯片通道上，用以提高纸芯片的导电性，提高其灵敏度；（6）在步骤（5）之后修饰用于捕捉抗体的硫堇；（7）利用抗原?抗体特异性识别和组装表面修饰技术等，将量子点?多孔硅复合材料标记的二抗修饰到步骤（6）之后的纸芯片表面上，制作电化学发光传感器;（8）处理好的纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电化学发光信号；（9）丝网印刷电极在使用前需要用抛光粉打磨光滑，备用；本专利技术所述使用石墨烯?金属复合纳米材料可以为石墨烯?Cu、石墨烯?Co，石墨烯?Pt，本专利技术所述使用量子点?多孔硅纳米材料可以为?CdTe量子点?多孔硅纳米材料，具体实施步骤包括：（1）手动印刷本实验所用胶片电极，并用三氧化二铝抛光粉将电极打磨光滑，备用；（2）使用蜡打印机打印如图1?A所示图案，并使用电子控温仪器对印蜡的色谱纸进行加热，使蜡均匀的渗透到色谱纸内部，未印蜡的区域形成纸芯片通道；（3）制备出石墨烯?金属和量子点?多孔硅复合纳米材料；（4）将100?200微升石墨烯?金属溶液滴到图1所示的a区域即通道区域；（5）待石墨烯?金属溶液在纸上完全干燥后，在a区域滴加10?100微升的硫堇溶液；（6）待硫堇溶液在纸上与碳纳米管结合完全，并稳定吸附于纸上后，a区域滴加10?100微升的戊二醛溶液，并等其自然干燥；（7）用超纯水冲洗三次，冲洗方法为：正面滴加缓冲溶液，在反面用吸水纸引水；（8）水干透后，在a区域滴加1?10微升的一抗；（9）重复步骤（7），洗去未吸附或吸附不牢固的抗体（10）待一抗溶液在a区域吸附稳固后，再滴加20?100微升的牛血清白蛋白溶液，以封闭可能得活性位点；（11）重复步骤（7）；（12）在a区域滴加与步骤（8）中分别相对应的1?10微升的抗原，使其反应完全；（13）在反应完全后，立即重复步骤（7）；（14）缓冲溶液洗脱后即可在a区域滴加相对应的5?20微升的量子点?多孔硅标记的二抗，使其充分反应；（15）之后立即重复步骤（7）；（16）在完成最后一步洗涤后，将纸芯片通道放置于制备好的胶片电极上，并滴加pH?7.4的缓冲溶液，再结合电化学发光仪进行测定，至此即可准确测定样品中抗原的浓度。...
【技术特征摘要】
1.本发明用石墨烯-金属和量子点-多孔硅复合纳米材料纸芯片电化学发光免疫传感器的制造方法，其特征包括以下步骤 (1)在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热，目的是将蜡烤化并使其均匀的渗透到色谱纸的内部，从而在未印蜡的部位形成亲水通道； (2)选择临床发病率较高的肿瘤标志物进行测定； (3)利用纳米材料，制备出石墨烯-金属复合纳米材料； (4)制备出量子点-多孔硅复合纳米材料，并用于标记二抗； (5)将石墨烯-金属复合纳米材料修饰于处理后的纸芯片通道上，用以提高纸芯片的导电性，提高其灵敏度； (6)在步骤(5)之后修饰用于捕捉抗体的硫堇； (7)利用抗原-抗体特异性识别和组装表面修饰技术等，将量子点-多孔硅复合材料标记的二抗修饰到步骤(6)之后的纸芯片表面上，制作电化学发光传感器； (8)处理好的纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电化学发光信号； (9 )丝网印刷电极在使用前需要用抛光粉打磨光滑，备用； 本发明所述使用石墨烯-金属复合纳米材料可以为石墨烯-Cu、石墨烯-Co，石墨烯-Pt，本发明所述使用量子点-多孔硅纳米材料可以为CdTe量子点-多孔硅纳米材料，具体实施步骤包括 (1)手动印刷本实验所用胶片电极，并用三氧化二铝抛光粉将电极打磨光滑，备用； (2)使用蜡打印机打印如图1-A所示图案，并使用电子...
【专利技术属性】
技术研发人员：于京华，刘芳，葛慎光，颜梅，葛磊，黄家栋，楚成超，李蒙，李龙，刘伟艳，王衍虎，张彦，王盼盼，李伟平，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
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