耐除草剂大豆植物及鉴定其的方法技术

本发明专利技术提供了特定的转基因大豆植物、植物材料和种子，其特征在于此类产物在大豆基因组的特定位置上具有一堆特定的转化事件。还提供了使得能够在生物样品中快速且明确地鉴定此类事件的工具。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉参考相关申请本申请要求2010年7月23日提交的美国临时专利申请No. 61/367，251 ;2009年 11月23目提交的美国临时专利申请No. 61/263，707 ;和2009年11月23日提交的欧洲专利申请No. EP09014565. 7的优先权，将所述每一个美国临时专利申请和欧洲专利申请的公开内容通过弓I用整体并入本文。专利
本专利技术涉及转基因大豆植物、植物材料和种子，其特征在于包含至少两个特定的转化事件，具体地在于至少两组编码赋予除草剂抗性的蛋白质的基因的存在，所述基因的组各自位于大豆基因组的特定位置。本专利技术的大豆植物将耐除草剂表型与在除草剂不存在的情况下等同于非转化大豆品系的不同遗传背景中的农艺性状、遗传稳定性和功能性组合。本专利技术还提供了用于鉴定包含特定转化事件EE-GM和EE-GM2或EE-GMl的植物材料在生物样品中存在的方法和试剂盒。专利技术背景植物中转基因的表型表达可通过基因本身的结构和通 过其在植物基因组中的位置来确定。同时转基因或“外源DNA”在基因组的不同位置上的存在可以以不同方式影响植物的总体表型。通过基因操作将具有商业吸引力的性状在农业或工业上成功能地引入植物视不同的因素而定可以是冗长的过程。遗传转化的植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤的第一步，所述一系列选择步骤包括广泛的遗传表征、繁育以及田间试验的评估，最终导致原种事件(elite event)的选择。基于关于新型食品/饲料、GMO和非-GMO产物的分离以及专利材料(proprietary material)的鉴定的讨论，原种事件的明确鉴定变得日益重要。理想地，这样的鉴定方法快速且简单，无需大量实验室装置。此外，所述方法应当提供使得能够明确鉴定原种事件而无需专家解释，但必要时经历得起专家的细查的结果。本文中描述了用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2的特殊工具。在本专利技术中，EE-GM3已在耐除草剂大豆(大豆(Glycine max))的开发中被鉴定为来自转基因大豆植物群体的良种事件，所述耐除草剂大豆包含与赋予对4-羟基苯丙酮酸二氧合酶(HPPD)抑制剂的抗性的基因组合的编码草甘膦抗性的基因，所述基因各自于植物可表达启动子的控制之下。EE-GMl和EE-GM2先前已被鉴定为在耐除草剂大豆(大豆)的开发中被鉴定为来自转基因大豆植物群体的原种事件，所述转基因大豆包含处于植物可表达启动子的控制之下的编码草胺膦抗性的基因，并且描述于W02006/108674和W02006/108675 (将两个公布通过引用并入本文)中。本领域已公开了包含耐除草剂基因的大豆植物。然而，现有技术公开内容没有一个教导或提出本专利技术。在本领域中已知在大豆植物中获得具有可接受的农艺性状、无产量抑制现象 (yield drag)以及提供足够的除草剂抗性(当然针对3个不同种类的除草剂)的商业耐除草剂原种转化事件绝不简单容易。事实上，已报导市场上发布的具有耐除草剂的第一大豆植物(事件40-3-2)与(近_)等基因系(isogenic line)相比较具有显著的产量抑制现象(Elmore等(2001)Agron. J. 93:408-412)。同样地，Optimum GAT 大豆(事件356043)经开发将对草甘膦的抗性与对ALS除草剂的抗性组合，但已报导此类大豆本身不满足草甘膦抗性的标准(无与另一种草甘膦抗性大豆事件(例如事件40-3-2)的组合(参见例如，www. bloomberg. corri/apps/news p i d=newsarch i ve&s i d=ad4L0hH9MKWE))。本专利技术的优选实施方案的概述本专利技术涉及转基因大豆植物、其种子、细胞或组织，所述转基因大豆植物、其种子、细胞或组织包含稳定地整合入其基因组的表达盒(所述表达盒包含含有2mEPSPS基因的编码序列的耐除草剂基因和含有HPH)-PF W336的编码序列的另一种耐除草剂基因(如本文实施例1.1中描述和SEQ ID No I中所示的两个基因))以及第二表达盒(所述第二表达盒包含含有草丁膦乙酰转移酶的编码序列的耐除草剂基因(如实施例1中描述的和SEQ IDNo 11中所示的))。所述转基因大豆植物或其种子、细胞或组织耐受基于草甘膦、基于草铵膦的除草剂以及HPro抑制剂除草剂例如异噁唑草酮，并且在除草剂不存在的情况下，具有大体上与非转基因等基因系相当的农艺性状。在施用一种或多种提供了针对其的抗性的除草剂后，植物将具有与非转基因植物相比较更优的农艺表型。根据本专利技术，大豆植物或其种子、细胞或组织包括原种事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3 和 EE-GM2。更具体地，本专利技术涉及转基因大豆、其种子、细胞或组织，其基因组DNA的特征在于这样的事实当在本文中描述的PCR鉴定方案中进行分析时，使用分别针对EE-GM3的和EE-GM-3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的两个引物，产生对于EE-GM3有特异性的片段，以及此外当在本文中描述的PCR鉴定方案中分析时，使用分别针对EE-GMl或EE-GM2的和包含草胺膦抗性基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的两个引物，产生对于EE-GMl或EE-GM2有特异性的片段。用于检测EE-GM3的引物可分别针对SEQ IDNO 2内的5’侧翼区域和包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域。用于检测EE-GM3的引物还可分别针对SEQ ID N0:3内的3’侧翼区域和包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，例如分别包含SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :4或SEQ ID No. :7的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物，并且产生100至800bp的DNA片段，例如约263bp或706bp的片段。用于检测EE-GMl的引物可分别针对SEQ ID NO : 12和包含耐除草剂基因的外源DNA内的5’侧翼区域。用于检测EE-GMl的引物还可分别针对SEQ IDNO 13和包含耐除草剂基因的外源DNA内的3’侧翼区域，例如分别包含SEQ ID N0:16和SEQ ID NO 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物，并且产生100至500bp的DNA片段，例如约183bp的片段。用于检测EE-GM2的引物可分别针对SEQ ID NO :14和包含耐除草剂基因的外源DNA内的5’侧翼区域。用于EE-GM2的检测的引物还可分别针对SEQ IDNO: 15和包含耐除草剂基因的外源DNA内的3’侧翼区域，例如，分别包含SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物，并且产生100至500bp的DNA片段，例如约151bp的片段。包含本专利技术的原种事件的EE-GM3的参照种子已在登录号NCMB 41659下保藏在NCMB。包含本专利技术的原种事件EE-GMl的参照种子已在登录号NCMB 41658下保藏在NCMB。包含本专利技术的原种事件EE-GM2的参照种子已在登录号NCMB 41660下保藏在NCIMB0包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的参照种子已在登录号PTA-11041下保藏在AT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.23 EP 09014565.7;2009.11.23 US 61/263,707;1.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和EE-GMl在生物样品中的同时存在的方法，所述方法包括利用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和利用特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GMl特异性区域。2.权利要求1所述的方法，所述方法包括使用利用至少两个引物的第一聚合酶链式反应，和使用利用至少两个引物的第二聚合酶链式反应，从存在于所述生物样品中的核酸扩增两个50至IOOObp的DNA片段，在所述第一聚合酶链式反应中，所述引物之一识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域或EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别EE-GM3的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ IDNo. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，或所述引物的另一个引物识别EE-GM3的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互补序列，或包含SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列，并且在所述第二聚合酶链式反应中，所述引物之一识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域或EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别EE-GMl的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列，或所述引物的另一个引物识别EE-GMl的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互补序列，其中所述第一聚合酶和第二聚合酶反应可以是相继的或同时的。3.权利要求2所述的方法，其中识别EE-GM3的5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸，并且其中识别EE-GMl的5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ IDNo 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GMl的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸。4.权利要求2所述的方法，其中识别EE-GM3的5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸，并且其中识别EE-GMl的5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GMl的3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GMl的外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQID No 11的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸。5.权利要求4所述的方法，其中所述EE-GM3特异性引物分别包含SEQID No. 5和SEQID No. 4的序列，或分别包含SEQ ID No 5和SEQ ID No. 7的序列，以及所述EE-GMl特异性引物分别包含SEQID No. 16和SEQ ID No. 17的序列。6.权利要求5所述的方法，所述方法包括使用EE-GM3PCR鉴定方案扩增约263或约706bp的EE-GM3特异性片段和扩增约183bp的EE-GMl特异性片段。7.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl在生物样品中的同时存在的试剂盒，所述试剂盒包括一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域的引物，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，和一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列，并且其中所述试剂盒还包括一种识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，或一种识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域的引物，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列，和一种识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQID No 11的核苷酸序列或其互补序列。8.权利要求7所述的试剂盒，其中识别EE-GM3的所述5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID Nol的核苷酸序列或其互补序列或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸，并且其中识别EE-GMl的所述5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GMl的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GMl的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸。9.权利要求7所述的试剂盒，其中识别EE-GM3的所述5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM3的所述3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的所述外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸，并且其中，识别EE-GMl的所述5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GMl的所述3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ IDNo 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GMl的所述外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸。10.权利要求7所述的试剂盒，其包括包含SEQID No. 4的序列的引物和包含SEQ IDNo. 5的序列的引物或包括包含SEQ ID No. 5的序列的引物和包含SEQ ID No. 7的序列的引物以及还包括包含SEQ ID No. 16的序列的引物和包含SEQ ID No. 17的序列的引物。11.一对引物，所述第一引物包含在最优化的检测条件下特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域内的序列的序列，所述5’侧翼区域包含SEQ IDNo 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，并且所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸的1408的互补序列的核苷酸序列，并且所述第二引物包含在最优化的检测条件下特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域内的序列的序列，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，并且所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列。12.权利要求11所述的引物对，其中所述第一引物包含选自SEQIDNo 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物包含选自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列。13.权利要求11所述的引物对，其中所述第一引物在其最3’末端包含选自SEQID No2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物在其最3’末端包含选自SEQ ID Nol2的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列。14.一对引物，其中所述第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列并且其中所述第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 16的序列。15.一种包含4种引物的装置， 第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列； 第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 4的序列； 第三引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 16的序列；和 第四引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 17的序列。16.权利要求1所述的方法，所述方法包括将生物样品的核酸与针对EE-GM3的第一特异性探针和与针对EE-GMl的第二特异性探针杂交。17.权利要求16所述的方法，其中所述第一特异性探针的序列与包含EE-GM3的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与包含EE-GMl的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。18.权利要求17所述的方法，其中所述第一特异性探针的序列与SEQID No. 2的核苷酸1431至1472或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。19.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl在生物样品中的同时存在的试剂盒，所述试剂盒包括能够与EE-GM3的特异性区域特异性杂交的第一特异性探针和能够与EE-GMl的特异性区域特异性杂交的第二特异性探针。20.权利要求19所述的试剂盒，其中所述第一特异性探针的序列与包含EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与包含EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。21.权利要求20所述的试剂盒，其中所述第一特异性探针的序列包含与SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性的序列，并且其中所述第二特异性探针的序列与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。22.—对用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl在生物样品中的同时存在的特异性探针。23.权利要求22所述的探针对，其包括第一探针和第二探针，所述第一探针包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与包含EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列或其互补序列具有至少80%的序列同一性，所述第二探针包含核苷酸序列，所述核苷酸与包含EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列或其互补序列具有至少80%的序列同一性。24.权利要求23所述的引物对，其中所述第一探针与SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二探针与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。25.一组用于鉴定原种事件EE-GM3和EE-GMl在生物样品中的同时存在的特异性探针，包括第一探针和第二探针，所述第一探针具有包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列的序列，所述第二探针具有与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。26.一种用于确认种子样品中的种子纯度的方法，所述方法包括用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和用特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GMl特异性区域。27.一种用于在种子批的样品中筛选种子的原种事件EE-GM3和EE-GMl的存在的方法，所述方法包括用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和用特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GMl特异性区域。28.—种通过与大体上互补的标记核酸探针杂交来检测原种事件EE-GM3和EE-GMl在生物样品中的存在的方法，其中通过再循环靶核酸序列来放大探针靶核酸比率，所述方法包括 a)将所述祀核酸序列与包含SEQID No 2的核苷酸1452至核苷酸1469的核苷酸序列或其互补序列的第一核酸寡核苷酸或包含SEQID No 3的核苷酸223至核苷酸240的核苷酸序列或其互补序列的所述第一核酸核苷酸杂交； b)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 2的核苷酸1434至核苷酸1451的核苷酸序列或其互补序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸258的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸，并且其中将所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸标记为所述标记核酸探针； c)用产生选择性探针切割从而导致双链体离解的酶仅切割探针靶核酸序列双链体内的标记探针，从而使所述靶序列保持完整；d)通过重复步骤(a)至(c)再循环所述靶核酸序列；和 e)检测切割的标记探针，从而确定所述靶核酸序列的存在；和 f)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 12的核苷酸210至核苷酸227的核苷酸序列或其互补序列的第三核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 13的核苷酸561至核苷酸568的核苷酸序列或其互补序列的所述第三核酸寡核苷酸杂交； g)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 12的核苷酸192至核苷酸209的核苷酸序列或其互补序列的第四核酸寡核苷酸或包含SEQID No 13的核苷酸569至核苷酸586的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第三寡核苷酸和第四寡核苷酸重叠至少一个核苷酸，并且其中将所述第三寡核苷酸或所述第四寡核苷酸标记为所述标记核酸探针； h)用产生选择性探针切割从而导致双链体离解的酶仅切割探针靶核酸序列双链体内的标记探针，从而使所述靶序列保持完整； i)通过重复步骤(f)至(h)再循环所述靶核酸序列；和 j)检测切割的标记探针，从而确定所述靶核酸序列的存在。29.—种各自在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl的转基因大豆植物或其细胞、部分、组织、种子或后代，已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM3的参照种子和已于保藏号NCMB 41658下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GMl的参照种子，或已于保藏号PTA-11041下保藏在ATCC的在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl的参照种子。30.权利要求29所述的转基因大豆植物、种子、细胞、组织、部分或后代，其基因组DNA，当使用针对EE-GM3的原种事件鉴定方案，利用两个分别包含SEQ ID 4和SEQ ID 5的核苷酸序列的引物进行分析时，产生约263bp的DNA片段，并且其基因组DNA，当使用针对EE-GMl的原种事件鉴定方案，利用两个分别包含SEQ ID16和SEQ ID 17的核苷酸序列进行分析时，产生约183bp的DNA片段。31.一种各自在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl的大豆植物、其植物部分或种子、细胞或组织，所述大豆植物可通过将包含原种事件EE-GM3的大豆植物与在其基因组中包含原种事件EE-GMl的大豆植物杂交来获得，所述包含原种事件EE-GM3的大豆植物可通过从已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得，所述包含原种事件EE-GMl的大豆植物可通过从于保藏号NCIMB41658下保藏在NCMB的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得，或所述大豆植物可通过从已于登录号PTA-11041下保藏在ATCC的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得。32.一种包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的大豆种子、已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的包含事件EE-GM3的参照种子、已于保藏号NCMB 41658下保藏在NCMB的包含事件EE-GMl的参照种子和已于保藏号PTA-11041下保藏在ATCC的包含事件EE-GM3和EE-GMl的参照种子。33.一种可从权利要求32所述的种子获得的包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的转基因大豆植物、植物部分、细胞或组织。34.—种用于产生包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的大丑植物或种子的方法,包括将根据权利要求29至33中任一项所述的植物与另一种大豆植物杂交，和种植获自所述杂交的种子。35.一种包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的大豆基因组DNA。36.一对分离的核酸分子,所述第一核酸分子包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1441至核苷酸1452或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含与SEQ ID No. 12的核苷酸199至核苷酸220或SEQ IDNo. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。37.权利要求36所述的分尚的核酸分子对,所述第一核酸分子包含与SEQID No. 2的核苷酸1431至核苷酸1462或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含与SEQ ID No. 12的核苷酸189至核苷酸230或SEQ ID No. 13的核苷酸548至589或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。38.一种大豆植物，其在其基因组中按顺序包含下列核苷酸序列 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列；和 g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列并且还按顺序包含下列序列 h)SEQ ID No 12的核苷酸I至209的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸340至核苷酸3461的核苷酸序列； j) SEQ ID 11的核苷酸I至核苷酸336的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； k) SEQ ID 11的核苷酸3462至核苷酸4076的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； 1)SEQ ID 11的核苷酸337至核苷酸3043的核苷酸序列； m) SEQ ID 13的核苷酸559至核苷酸568的核苷酸序列；和 n) SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列。39.一种按顺序包含下列核苷酸序列的DNA分子 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列； g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列；以及还按顺序包含下列序列 h)SEQ ID No 12的核苷酸I至209的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸340至核苷酸3461的核苷酸序列；j) SEQ ID 11的核苷酸I至核苷酸336的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； k) SEQ ID 11的核苷酸3462至核苷酸4076的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； 1)SEQ ID 11的核苷酸337至核苷酸3043的核苷酸序列； m) SEQ ID 13的核苷酸559至核苷酸568的核苷酸序列；和 n) SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列。40.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和EE-GM2在生物样品中的同时存在的方法，所述方法包括用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和用特异性识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM2特异性区域。41.权利要求40所述的方法，所述方法包括使用利用至少两个引物的第一聚合酶链式反应，和使用利用至少两个引物的第二聚合酶链式反应，从存在于所述生物样品中的核酸扩增两个50至IOOObp的DNA片段，在所述第一聚合酶链式反应中，所述引物之一识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域或EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别EE-GM3的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，或所述引物的另一个引物识别EE-GM3的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互补序列，或包含SEQ ID No. 20的核苷酸位置...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·T·梅森，L·J·莱托，M·A·艾比，W·H·艾比，G·威尔兹，S·维尔哈格，M·德伯克利尔，V·哈贝克斯，JM·菲卢洛，
申请(专利权)人：拜尔作物科学股份有限公司，MS技术有限责任公司，
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