鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法、应用及药物组合物、制剂和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法、应用及药物组合物、制剂和试剂盒。本发明专利技术的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）调制抗原液、（2）免疫母鸡、（3）分离、纯化卵黄免疫球蛋白。体内体外实验表明，本发明专利技术制备得到的特异性IgY与鲍曼不动杆菌具有特异结合活性，可以有效抑制鲍曼不动杆菌的生长及其产生的毒性效应，可用于鲍曼不动杆菌感染性疾病及其并发症的防治和诊断分析，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法、应用及药物组合物、制剂和试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法、应用及药物组合物、制剂和试剂盒。
技术介绍
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌,是不动杆菌中引起人类感染的主要菌群，主要引起呼吸道感染、菌血症、泌尿系统感染、伤口感染、脑膜炎等，亦可引起腹膜炎、心内膜炎、眼内炎等，最常见的感染部位为肺部，是医院获得性肺炎的重要致病原。随着临床抗菌药物的大量使用，鲍曼不动杆菌的耐药性也越来越强，已对头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类等常用抗菌药物出现多重耐药性，甚至对碳青烯霉类药物包括亚胺培南或美洛培南在内均出现耐药性，这给临床治疗带来极大困难。卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin, IgY)是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下所产生并沉积在卵黄中的能与抗原发生特异性反应的一种免疫球蛋白，是禽类在长期进化过程中形成的用于提高抵抗力的物质。IgY除具有特异性强、价廉易得、性质稳定等优点外，与化学药物相比无毒副作用，与抗生素相比不易产生耐药性，因而倍受青睐。美国 FDA已将特异性卵黄抗体视为替代抗生素的首要候选药物，日本政府投入巨资扶持“禽源抗体产业”。目前，多种特异性IgY已经在人类和动物疾病的预防和治疗方面得到了应用。特异性IgY在人类疾病防治中的应用包括婴儿轮状病毒性腹泻、幽门螺杆菌感染、龋齿等，但在鲍曼不动杆菌感染性疾病防治中的应用目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备方法及应用、以及由该IgY制备得到的药物组合物、制剂和试剂盒。具体而言，本专利技术的所述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法包括如下步骤(I)调制抗原液将鲍曼不动杆菌菌种接种于TSB液体培养基中，37°C培养18_24h后，离心收集菌体，菌体以生理盐水稀释至108-101(lCfu/mL，向菌液中加入菌液体积O. 5%的甲醛，37°C灭活 24h，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4°C保存；(2)免疫母鸡选用140-160日龄的产蛋母鸡，于每只鸡胸肌注射2点、颈部皮下注射I点进行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗为加入弗氏完全佐剂的抗原液，加强免疫的疫苗为加入弗氏不完全佐剂的抗原液，三次免疫剂量递增，分别为每只鸡I. OmLU. 5mL和2. OmL，每次免疫间隔14天，收集首次免疫后1-160天的鸡蛋于4°C分类保存；(3)分离、纯化卵黄免疫球蛋白取免疫鸡蛋，擦洗消毒，去蛋壳，用蛋黄分离器去除蛋白，而后用无菌滤纸进一步吸取蛋白，刺破蛋黄膜收集蛋黄，卵黄液加6-10倍体积的去离子水稀释，用盐酸调pH至5. O,搅匀后4°C放置过夜,在4°C下IOOOOrpm离心25min,取上清液,进行盐析后,盐析溶液经超滤、冷冻干燥得冻干粉。其中，所述鲍曼不动杆菌菌种可以使用市售的鲍曼不动杆菌标准菌，也可以使用医院分离获得的多药耐药性鲍曼不动杆菌。本专利技术的所述应用包括上述制备的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白在制备用于防治鲍曼不动杆菌感染性疾病的药物中的应用和在制备用于分析诊断鲍曼不动杆菌感染性疾病的药物中的应用。在上述应用中，所述鲍曼不动杆菌感染性疾病一般是指鲍曼不动杆菌感染性的呼吸道感染、菌血症、泌尿系统感染、伤□感染、脑膜炎、腹膜炎、心内膜炎、眼内炎中的一种或两种以上，尤其是指鲍曼不动杆菌感染性肺炎或菌血症。本专利技术还提供一种药物组合物及其制剂。所述药物组合物包含上述制备的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白和药学上可接受的辅料。所述制剂是由上述药物组合物制备得到的制剂，为口服制剂、注射制剂或外用制剂，包括片剂、胶囊剂、微囊剂、注射剂、输液、软膏剂等。作为片剂，可根据治疗剂量及效价，将适量上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白冻干粉与填充剂(如可压性淀粉)、崩解剂(如微晶纤维素)、润滑剂(如微粉硅胶、滑石粉)混合，干法制粒后压片或直接压片，然后根据需要进行包衣。作为胶囊剂，可根据治疗剂量及效价，将适量上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白冻干粉与填充剂(如糊精)混合均匀，填入胶囊。作为微囊剂，可根据治疗剂量及效价，将适量上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的溶液与囊材(如氰基丙烯酸丁酯单体)按照乳化聚合两步法，以泊洛沙姆188为稳定剂，制成纳米囊或微囊，然后进一步制成其它剂型。作为注射剂，可将一定浓度的上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的溶液与等渗调节剂(如葡萄糖)、稳定剂(如半胱氨酸)混合，O. I μ m滤过除菌，根据治疗剂量及效价分装。作为软膏剂，可根据治疗剂量及效价，将适量上述鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白与空白软膏剂基质(如由聚乙二醇4000及聚乙二醇400组成的混合物)及防腐剂(如对羟基苯甲酸乙酯)混合均匀进行制备。此外，本专利技术制备的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白还可以试剂盒的形式提供，所述试剂盒中包括上述制备的鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白，还可以包括酶底物和稳定剂、缓冲剂等其他各种添加剂。体内体外实验表明，本专利技术制备得到的特异性IgY与鲍曼不动杆菌具有特异结合活性，可以有效抑制鲍曼不动杆菌的生长及其产生的毒性效应，可用于鲍曼不动杆菌感染性疾病及其并发症的防治和诊断分析，具有广阔的应用前景。附图说明 图I为M组和Q组各步纯化后的特异性IgY的电泳图。图中的条带I. M组特异性IgY的超滤组分；2. M组特异性IgY的二次盐析组分；3. IgY标准品；4. M组特异性IgY的一次盐析组分；5. M组特异性IgY的水溶性组分；6. Q组特异性IgY的超滤组分；7. Q组特异性IgY的二次盐析组分；8. Q组特异性IgY的一次盐析组分；9. Q组特异性IgY的水溶性组分。图2表示用M组特异性IgY免疫后不同时间卵黄水溶性组分的抗体效价。图3表示用Q组特异性IgY免疫后不同时间卵黄水溶性组分的抗体效价。图4表示M组特异性IgY对M菌的生长抑制作用。图5表示Q组特异性IgY对M菌的生长抑制作用。图6表示M组特异性IgY对Q菌的生长抑制作用。图7表示Q组特异性IgY对Q菌的生长抑制作用。具体实施方式一、IgY 的制备下面的实施例1、2中分别采用两种不同来源的鲍曼不动杆菌作为抗原免疫母鸡， 制备两种鲍曼不动杆菌特异性IgY，分别命名为M组和Q组。实施例I (M组特异性IgY)(I)调制抗原液将鲍曼不动杆菌标准菌(ATCC-BAA1605，购自美国标准生物品收藏中心(American type culture collection),大连辰IE生化试剂公司经销)(简称M菌)接种于TSB液体培养基中，37°C培养20h后，于6000rpm离心15min收集菌体，菌体以生理盐水稀释至IO9Cfu/ ml，血球计数板计数。然后向菌液中加入菌液体积O. 5%的甲醛，37°C灭活24h，不时摇动。 经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4°C保存。注射前疫苗如发生分层现象，则需充分混匀后使用。(2)免疫母鸡选用1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）调制抗原液将鲍曼不动杆菌菌种接种于TSB液体培养基中，37℃培养18?24h后，离心收集菌体，菌体以生理盐水稀释至108?1010cfu/mL，向菌液中加入菌液体积0.5%的甲醛，37℃灭活24h，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4℃保存；（2）免疫母鸡选用140?160日龄的产蛋母鸡，于每只鸡胸肌注射2点、颈部皮下注射1点进行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗为加入弗氏完全佐剂的抗原液，加强免疫的疫苗为加入弗氏不完全佐剂的抗原液，三次免疫剂量递增，分别为每只鸡1.0mL、1.5mL和2.0mL，每次免疫间隔14天，收集首次免疫后1?160天的鸡蛋于4℃分类保存；（3）分离、纯化卵黄免疫球蛋白取免疫鸡蛋，擦洗消毒，去蛋壳，用蛋黄分离器去除蛋白，而后用无菌滤纸进一步吸取蛋白，刺破蛋黄膜收集蛋黄，卵黄液加6?10倍体积的去离子水稀释，用盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，在4℃下10000rpm离心25min，取上清液，进行盐析后，盐析溶液经超滤、冷冻干燥得冻干粉。...

【技术特征摘要】
1.一种鲍曼不动杆菌特异性卵黄免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)调制抗原液 将鲍曼不动杆菌菌种接种于TSB液体培养基中，37°C培养18-24h后，离心收集菌体，菌体以生理盐水稀释至108-101Qcfu/mL，向菌液中加入菌液体积0. 5%的甲醛，37°C灭活24h，不时摇动，经无菌检验合格后分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，充分乳化后制成全菌灭活疫苗，4°C保存； (2)免疫母鸡 选用140-160日龄的产蛋母鸡，于每只鸡胸肌注射2点、颈部皮下注射I点进行免疫，共免疫三次，首次免疫的疫苗为加入弗氏完全佐剂的抗原液，加强免疫的疫苗为加入弗氏不完全佐剂的抗原液，三次免疫剂量递增，分别为每只鸡I. OmLU. 5mL和2. OmL，每次免疫间隔14天，收集首次免疫后1-160天的鸡蛋于4°C分类保存； (3)分离、纯化卵黄免疫球蛋白 取免疫鸡蛋，擦洗消毒，去蛋壳，用蛋黄分离器去除蛋白，而后用无菌滤纸进一步吸取蛋白，刺破蛋黄膜收集蛋黄，卵黄液加6-10倍体积的去离子水稀释，用盐酸调pH至5. 0，搅匀后4°C放置过夜,在4°C下IOOOOrpm离心25min,...

【专利技术属性】
技术研发人员：甄宇红，龙亚一，侯源源，孙丽丹，廖瀚，丰雪，舒晓宏，孙永，韩文琦，赵亚丽，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：