适用于脐带组织衍生干细胞的脐带组织冷冻保存制造技术

在此披露一种保存脐带的方法，该方法包括：获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块；将脐带组织块与冷冻组合物混合以形成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，摇晃时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；然后冷冻保存该混合物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于干细胞，特别是关于脐带组织衍生干细胞。本申请主张2011年9月I日提出申请的台湾专利申请第100131519号的优先权，该申请的整体内容在此以引用的方式并入本申请。
技术介绍
前人已提出保存婴儿脐带血的潜在好处，现在，科学家则要进一步保存实际的脐带组织。此想法是要保存出生时的一段脐带与其内的所有细胞，并将脐带组织冷冻在低温储槽内以利长期保存。未来如果需要婴儿的细胞做为治疗之用，即可以当时最先进的技术处理脐带组织，进而撷取出细胞。 脐带(脐带组织)内的华通氏胶富含多能间质干细胞(MSC)，其于再生医学上具有巨大潜力。MSC可分化为骨骼、软骨、神经、脂肪、心脏、平滑肌、肝脏与皮肤细胞。然而，无论就保存或后续的细胞培养而言，以上所述均属相当新颖的
，尚须建立一套有效率的作业流程。
技术实现思路
在一个实施方式中，本专利技术是关于一种保存脐带的方法。该方法包括获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块，其中各脐带组织块的尺寸不大于2毫米(mm);将脐带组织块与冷冻组合物混合以形成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于28分钟但亦不超过32分钟；然后冷冻保存该混合物。在另一个实施方式中，本专利技术是关于一种保存脐带的方法，其包括获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块；将脐带组织块与冷冻组合物混合以形成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；然后冷冻保存该混合物。在另一个实施方式中，本专利技术是关于一种从一段脐带中获取脐带组织衍生干细胞的方法，其包括获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块；将脐带组织块与冷冻组合物混合以形成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于20分钟但亦不超过40分钟；冷冻保存该混合物；将该混合物解冻，并去除冷冻组合物；然后在培养介质中培养脐带组织块，以获得脐带衍生干细胞。在另一个实施方式中，本专利技术是关于一种冷冻组合物，其包括a)血清白蛋白或人类血清；与13)冷冻保护剂，其中组合物不含非人类动物衍生组分。在另一个实施方式中，本专利技术是关于一种冷冻组合物，其包括30%至50%的人类脐带血血清或2. 5%至25%的血清白蛋白；5. 5%至55%的二甲基亚砜(DMSO);与0. 5%至5%的葡聚糖。在参阅以下较佳实施例的说明及附图后，即可清楚了解上述与其它实施方式。本领域的技术人员可提出变化例与修正例而不脱离本案新颖概念的实质与范围。附图显示本专利技术一个以上的实施例，图式的作用是与书面说明共同解释本专利技术的原理。在可能情况下，所有图式均以相同的参考标号表示同一实施例中相同或类似的组件。附图说明图IA至IE为显微照片，分别显示仅以酶处理而未经冷冻保存、冷冻保存前先以酶处理、未以酶处理也未经冷冻保存、冷冻保存后以酶处理，以及仅冷冻保存而未以酶处理的切碎脐带组织块衍生细胞。图2A至 2C显不突光激活细胞分选法(Fluorescence Activated Cell Sortingorf I ow cy tome try, FACS)或流动式细胞测量法的分析结果,其分析对象分别为冷冻保存前先以酶处理、冷冻保存后以酶处理，以及仅冷冻保存而未以酶处理的切碎脐带组织块衍生细胞。图3显示衍生自切碎脐带组织块的细胞数量，其中切碎脐带组织块分别为未接受酶处理，及在冷冻保存之前或之后接受酶处理。 图4显示切碎脐带组织块衍生细胞未经过冷冻保存及经过冷冻保存之后的倍增时间。图5为显微照片，分别显示切碎脐带组织块(左图)与滤液(右图)的细胞培养物。图6A与6B分别显示衍生自切碎脐带组织块与非切碎脐带组织块的群落数量与细胞数量。图7显示干细胞标记基因的RT-PCR分析结果。图8A为显微照片，显示切碎脐带衍生干细胞与造血干细胞共同培养物中的鹅卵石构造。图SB显示RT-PCR的分析结果，其分析对象为脐带组织衍生干细胞上与细胞增殖相关的信号途径。图9A至9C为显微照片，分别显示从切碎脐带组织衍生干细胞分化而成的脂肪细胞、软骨细胞与血管内皮细胞。图IOA至IOF显示细胞在接受血管生成诱导前(图IOA至10C)、后(图IOD至10F)的荧光激活细胞分选法(FACS)或流动式细胞测量法的分析结果。图11显示干细胞群落形成单位的数量与脐带组织以冷冻保护剂溶液培养的时间长短的关系。具体实施例方式定义本申请说明书所使用的术语在本专利技术范围内及各术语的特定上下文中大致具有其相关领域中的通常涵义。本说明书中用以描述本专利技术的特定用语将在下文中或在本说明书的他处加以说明，以利业界人士了解本专利技术的相关叙述。为便于阅读，某些术语可能会以斜体及/或引号等格式加以凸显，但使用这些凸显格式并不影响术语的范围与意义。同一术语在相同上下文中的范围与意义皆相同，此与是否采用凸显格式无关。此外，同一件事的表示方法不止一种。因此，本文所讨论的术语均可以替代用语及同义词取代，且一术语是否在本文中经详细说明或讨论，并无任何特别意义。本文提供某些术语的同义词，但使用某一或多个同义词并不表示排除其它同义词。本说明书所提供的范例，包括此处所讨论的术语范例，仅供说明之用，而非用于局限本专利技术或任何例示术语的范围与意义。同样的，本专利技术并不限于本说明书所列举的各种实施例。除非另有定义，否则本文中所有技术与科学术语的含义均与本领域技术人员所普遍了解者相同。若有相互冲突之处，则以本说明书及其所提供的定义为解释依据。在本文中，「左右」、「约」或「大约」均指已知数值或范围的20%以内，较佳者为10%以内，更佳者则为5%以内。本文所列的数量为约略值，亦即纵使未明白写出「左右」、「约」或「大约」等词，仍带有该等用词的含义。在本文中，「脐带组织块」与「切碎的脐带组织」两词可以互换。切碎的脐带组织块是指一块尺寸小于O. 5厘米(cm)的脐带组织。在本文中，脐带组织块的尺寸不超过O. 4厘米，或不超过O. 3厘米，或不超过O. 2厘米。脐带组织块的尺寸不超过O. 2厘米是指该脐·带组织块可通过筛孔大小为2毫米(mm)的细胞过滤器。在本文中，「一段脐带组织」是指脐带的一部分，其长度为O. 5厘米或超过O. 5厘米。一段脐带组织可为O. 5、1、2或3厘米，甚至超过3厘米。「冷冻保存法」或「冷冻保存」均指同一方法，其中是将细胞或整个组织冷却至零度以下的低温，通常为77K或零下196°C (液态氮的沸点)，借以达到保存细胞或整个组织的目的。在此等低温下，任何生物活性，包括会导致细胞死亡的生化反应，皆能得到有效遏制。然而，若不使用冷冻保护剂溶液，则被保存的细胞往往会在接近低温或回暖至室温的过程中因冷冻而受损。「冷冻」与「冷冻保存」两词可以互换。「冷冻组合物」、「冷冻溶液」、「冷冻保存组合物」与「抗冻溶液」等词可以互换。除非另有规定，否则「脐带组织衍生细胞」、「脐带组织块衍生细胞」、「脐带组织衍生干细胞」与「脐带组织衍生MSC」等词可以互换。「倍增时间」是指尺寸或数值增加一倍所需的时间。在一个实施方式中，本专利技术是关于一种保存脐带的方法。该方法包括获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块，其中各脐带组织块的尺寸不大于2毫米；将脐带组织块与冷冻组合物混合成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种保存脐带的方法，包括下列步骤：获取一段脐带；将脐带切碎成脐带组织块，其中各脐带组织块的尺寸皆不大于2毫米；将该脐带组织块与冷冻组合物混合，以形成混合物，其中冷冻组合物包括冷冻保护剂与蛋白质；摇晃该混合物，且摇晃的时间不少于28分钟但亦不超过32分钟；以及冷冻保存该混合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：章修纲，罗玮瑜，
申请(专利权)人：生宝生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：