用作疫苗的融合抗原制造技术

本发明专利技术关于一种用作疫苗的融合抗原。该融合抗原包含配体部分、假单胞菌外毒素Ａ易位结构域ＩＩ、抗原部分以及羧基末端部分。该配体部分能够与靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合。该羧基末端部分包含具有ＫＤＥＬ序列的多肽。该抗原部分源于选自由ＰＲＲＳＶ、马动脉炎病毒、ＩＩ型环状病毒、人免疫缺陷病毒、乳酸脱氢酶增高病毒以及猴出血热病毒组成的组中的病原体。本发明专利技术还公开了使用该融合抗原的药物组合物与使用该融合抗原诱发免疫反应的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种融合抗原。更具体而言，本专利技术涉及一种用作T-细胞疫苗的融 合抗原。
技术介绍
细胞介导的免疫反应依赖T-淋巴细胞与载有T-细胞识别抗原的细胞之间的直接 交互作用。在受感染的体细胞中，病毒利用细胞本身的合成机制在细胞内复制，而T-细 胞则识别受病毒感染的体细胞。然而，在病毒复制过程中所产生的抗原会出现在受感染 细胞的表面(MHC I类)，被杀伤性T-细胞(CD8+T-细胞)识别，杀伤性T-细胞可在病毒 复制完成前杀死细胞以控制感染。 用于预防病毒感染的疫苗通常为活体减毒生物，其致病性虽已减弱，但可剌激 保护性免疫。当病毒复制形成内源性加工肽时，用作减毒活疫苗的活病毒的外源蛋白在 抗原呈递细胞(APC)的内质网(ER)腔中被识别与加工。上述加工过程包括抗原修饰以及 适度消化。然而，减毒活疫苗，尤其是RNA病毒，具有强烈的毒性和毒力恢复的倾向。 例如，传染性喉气管炎病毒(ILTV)的疫苗与减毒株两者皆有毒性恢复的情形。此外，病 毒必须经历多次传代。因此其唤起免疫反应的能力受到质疑。开发减毒活疫苗是一项费 时的工程。 为防止减毒活疫苗恢复毒性，正在开发如假狂犬病疫苗、gl基因缺失疫苗以及 PRV标记疫苗等基因缺陷疫苗。 使用牛痘或禽痘的病毒或细菌作为携带抗原基因载体。通过DNA重组技术， 可縮短优良疫苗的研发时间，且可同时取得同一疫苗的多种血清型。这些疫苗的实例为 禽痘病毒及沙门氏菌载体系统及美国的SyntroVet基因重组疫苗。另一方面，在使用微 生物，尤其是RNA病毒，作为载体疫苗时，这些微生物会衍生新品种或新菌株。这些 载体疫苗的安全性再次受到挑战。此外，传统重组亚单位疫苗对于触发细胞介导的免疫 反应通常效果不彰。重组亚单位疫苗为外源性抗原，会被摄入巨噬细胞、树突状细胞与 B-淋巴细胞内。这种来自外源性抗原且带有免疫原表位的肽是在抗原透过液相胞饮作用 或膜结合受体而内化至APC之后产生。然后在APC的内体区室中产生肽，并通过空的 MHCII类分子将其分类，从而基于MHCII类分子与肽间的亲合性，形成肽-MHCII类复 合物。肽-MHCII类复合物然后易位至APC表面，以便被CD4+T-细胞识别。然而，由 CD8+T-细胞识别的亚单位型蛋白并不能成为有效的疫苗，因为其一旦施用，便被内化至内体区室内，且可能于该处大幅降解或无法与MHCI类途径产生交互作用。此外，CD4+ 细胞(Th细胞)可分别通过Thl与Th2辅助T-细胞激活体液免疫反应与细胞介导的免疫 反应。Thl与Th2细胞可彼此调节以达到体液免疫与细胞介导的免疫反应的平衡。 可感染如T-细胞、B-细胞、树突细胞、单核细胞或巨噬细胞的免疫细胞的病 毒已有相关发现与研究。这种感染猪的病毒的实例为猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)与II型环状病毒，以及感染人的病毒的人免疫 缺陷病毒。这些病毒在抗原呈递细胞中关闭识别作为抗原的外源蛋白的能力。当免疫细 胞无法唤起免疫反应并载运病毒时，已被这些类型病毒感染的动物极易受到其它病原体 的二次感染。不幸的是，目前仍缺乏可针对感染病毒的免疫细胞产生作用的有效疫苗。 尤其，猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)每年皆对畜牧业造成高额损失。该病 毒感染巨噬细胞(肺泡及脾脏内)、脑部小胶质细胞及单核细胞，并存在于被感染动物的 血液及器官中。抗体对此病毒的效果不大，甚至剌激病毒突变。在抗体依赖性增强作 用(ADE)的机制中，抗体的使用反而引发更严重的感染。大约50%至80%的猪受到该 种病毒感染。通常，被该病毒感染的动物无明显症状，但被感染动物的免疫力降低。由 于二次感染，这导致增重率降低与死亡率升高。PRRSV为一种RNA病毒。除了猪， 鸭类亦可能感染PRRSV。目前已有用于抵抗PRRSV的减毒活疫苗问世。然而，病毒 于活体疫苗中的突变经常发生。所幸近期的HIV疫苗研发报告已明确指出杀伤性T-细 胞(CTL)为控制HIV感染所必须(Hanne G-S et al.， 2000， Journal of virology, volJ4， No.4.p.l694-1703)。开发一种安全有效的PRRS疫苗实为当务之急。 因此，如何解决现有技术的缺失与不足，尤其是研发可抵抗病毒感染的T-细胞 疫苗，已是产学界刻不容缓之要务。
技术实现思路
在一个技术方案中，本专利技术涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其包含(a)抗原 部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结 合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II ;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序 列KDEL的多肽。该抗原部分源于猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORFlb。 在另一技术方案中，本专利技术涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其主要由以下部 分组成(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II ;以及(d)羧基末端部分，其包 含具有氨基酸序列KDEL的多肽。该抗原部分源于综合征PRRSV ORFlb。 在又一技术方案中，本专利技术涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其包含(a)抗原 部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结 合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II ;以及(d)羧基末端部分，其包含具有氨基酸序 列KDEL的多肽。该抗原部分源于选自由马动脉炎病毒、II型环状病毒、人免疫缺陷病 毒、乳酸脱氢酶增高病毒以及猴出血热病毒组成的组中的病原体。 在又一技术方案中，本专利技术涉及一种靶细胞特异性融合抗原，其主要由以下部 分组成(a)抗原部分；(b)配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；(c)假单胞菌外毒素A易位结构域II;以及(d)羧基末端部分，其包含4具有氨基酸序列KDEL的多肽。该抗原部分源于选自由马动脉炎病毒、II型环状病毒、 人免疫缺陷病毒、乳酸脱氢酶增高病毒以及猴出血热病毒组成的组中的病原体。附图说明 图IA说明PRRSVORF lb亚克隆片段Nsp ll(核苷酸10805 核苷酸11297，上 半部)与蛋白片段Nsp 10及Nspll加K13的对应的氨基酸序列(下半部)。 图IB说明图1A中蛋白片段对应的三字母氨基酸序列(SEQIDNO : 1)。 图2说明M12-K13DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO : 2)。 图3说明质粒pPE-K13图谱，其中PE代表PE( A III)。 图4说明质粒pPE-M12-K13图谱，其中PE代表PE( A III)。 图5说明融合抗原PE-M12-K13及PE-DgD-K13在免疫小鼠的脾细胞中诱发抗原 特异性IFNY的分泌。 图6说明融合抗原PE-M12-K13及PE-DgD-K13在免疫小鼠的脾细胞中诱发抗原 特异性TNFa的分泌。具体实施例方式本说明书通篇所用术语，其在本专利技术范围内及在本说明书特定上下文中的解释 大致均依照各术语于本领域中的通常涵义。本说明书中用以描述本专利技术之特定用语将 于下文中或于本说明书他本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶细胞特异性融合抗原，包含：　　　　ａ．抗原部分；　　　　ｂ．配体部分，　　　　其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；　　　　ｃ．假单胞菌外毒素Ａ易位结构域Ⅱ；以及　　　　ｄ．羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列ＫＤＥＬ的多肽；　　　　其中，所述抗原部分源于猪生殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）ＯＲＦ１ｂ。

【技术特征摘要】
US 2007-11-30 11/948,327一种靶细胞特异性融合抗原，包含a.抗原部分；b.配体部分，其能够与所述靶细胞上的受体反应、识别该受体或者与该受体结合；c.假单胞菌外毒素A易位结构域II；以及d.羧基末端部分，其包含具有氨基酸序列KDEL的多肽；其中，所述抗原部分源于猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF1b。2. 如权利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分源于PRRSVNsplO与Nspll。3. 如权利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分包含具有SEQIDNO: l所述 氨基酸序列的多肽。4. 如权利要求1所述的融合抗原，其中，所述抗原部分包含多肽，该多肽是具有SEQID NO : 2所述核苷酸序列的DNA片段的翻译产物。5. 如权利要求1所述的融合抗原，其中，所述羧基末端部分包含具有氨基酸序列KKDELRXELKDEL的多肽，其中X为V或D。6. 如权利要求1所述的融合抗原，其中，所述配体部分为假单胞菌外毒素A结合域I。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：廖朝暐，翁仲男，章修纲，
申请(专利权)人：生宝生物科技股份有限公司，财团法人台湾动物科技研究所，
类型：发明
国别省市：71[]