本发明专利技术为一种镍-双缩脲试剂盒的制备方法、产品及应用方法。本发明专利技术产品的制备方法包括如下步骤：1）将1.0~1.4mol/L氢氧化钠用0.14~0.2mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；2）将0.05~0.07mol/L三乙醇胺、0.17~0.23mol/L柠檬酸三钠、0.015~0.025mol/L六水合硫酸镍分别用0.14~0.2mol/L氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:（4~5）:(2~3)的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂。3）使用时将A组试剂与B组试剂以4：1~6：1的比例混合，得镍-双缩脲试剂。本发明专利技术的优点是：对各种蛋白显色的一致性好且灵敏度较高，线性范围大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
测定尿或脑脊液总蛋白的方法有许多，但就对各种蛋白显色的一致性来讲，双缩脲显色法的均一性还是最好的。如目前最常用的邻苯三酹红钥法(PyrogaUol Red.fnolybdate)和氯化节甲乙氧铵(Benzethonium Chloride)尿总蛋白质测定，前者为染料结合法后者为浊度法。由于两者都与白蛋白和球蛋白反应灵敏性存在差异，故不能准确表达蛋白含量，而双缩脲法是利用了蛋白质的多肽键，所以显色和蛋白质种类没关系。临床大多采用铜双缩脲法，但是其显色不太敏感，通常只能用于检测血清总蛋白等含量较高的体液，而对尿、脑脊液蛋白却需要沉淀离心浓缩步骤而不能直接检测。而已报道的镍-双缩脲 试剂稳定性、检测灵敏度也都不能同时达不到对尿、脑脊液蛋白直接检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种不需沉淀离心浓缩即可直接测定尿液或脑脊液总蛋白的。本专利技术是这样实现的一种镍-双缩脲试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤 1)制备A组试剂将I.(Tl. 4 mol/L氢氧化钠用O. Γθ. 2mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；2)制备B组试剂将O.05 O. 07mol/L三乙醇胺、O. 17 O. 23mol/L柠檬酸三钠、O.015^0. 025 mol/L六水合硫酸镍分别用O. 14^0. 2mol/L氯化钠溶液进行溶解,然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3: (Γ5)(2^3)的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂； 3)将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以4:1飞I体积比的比例混合，得镍-双缩脲试剂。步骤2中所述三乙醇胺优选为O. 06mol/L。所述步骤I、步骤2中所述氯化钠溶液分别优选为O. 154 mol/L。—种如上所述的镍-双缩脲试剂的制备方法所制得的产品。一种如上所述的镍-双缩脲试剂盒的制备方法所制得产品的应用方法，包括如下步骤 a)在浓度为(T8000mg/L的范围内，用3 7个不同浓度定标液测定总蛋白，得出定标曲线. b)测定被测样本总蛋白含量在以下两种方式中选择一种方式一手工比色法取所述A组试剂I. 8 2. 8ml与B组试剂0. 3 0. 7ml混合，然后加入0. 25 0. 35ml被测样本混合后，放置30°C 40°C水浴2 4小时或避光室温16 48小时；用分光光度仪测定吸光值，并用空白镍-双缩脲试剂校零，最终测得的结果与步骤a中所述定标液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量；方式二 生化自动仪测试法取A组试剂0.18 O. 28ml加入被测样本O. 025 O. 035ml，混合后放入生化自动仪中，在30°C 40°C水浴4^7分钟后测定吸光值，然后加入B组试剂O. 03、. 07ml混合后继续水浴1(Γ25分钟，测定吸光值，最终测得结果与所述定标液的定标曲线进行对照，根据定标曲线得出被测样本总蛋白含量。步骤b的手工比色法中所述分光光度仪在波长为420nnT 470nm处进行吸光值测定。步骤b中所述被测样本的总蛋白含量在50mg/L 8000mg/L范围内呈线性。 所述步骤b的生化自动仪测试法中测定吸光值时所在的主波长为420nnT470nm，副波长为650nm 700nm。所述被测样本在尿液样本、脑脊液样本中任选一种。所述步骤b的手工比色法中，所述空白镍-双缩脲试剂是指取所述A组试剂1.8^2. 8ml与B组试剂O. 3^0. 7ml混合，然后用等量的生理盐水或蒸馏水代替被测样本加入到A组试剂与B组试剂的混合液中，所述空白镍-双缩脲试剂用于对被测样本所测得的颜色进行校准。本专利技术专利技术原理及效果如下 I、本专利技术所述的空白镍-双缩试剂为浅黄色，6个内月稳定，镍-双缩脲试剂与被测样本混合后最终产物为深黄。根据本专利技术用镍-双缩脲试剂盒测定尿液或脑脊液总蛋白的应用方法(简称镍双缩法)，消光系数可达到O. 459，而铜Doumas法双缩法复合物消光系数为O. 298，比铜双缩法高出54%，恰好达到了能够测定尿液总蛋白的最低要求。其光谱吸收曲线用SHIMABEU-2550型分光光度仪进行扫描，吸收峰为440nm。但是若通过手工比色法，要完成整个反应在37°C需3小时，为了适合自动化分析仪的应用，对生化自动仪的测定过程进行改进，缩短了反应时间，增加了定标点，最后标准曲线呈现抛物线。定标液的蛋白最高定标浓度是2000mg/L，但经过测定，本专利技术在定标曲线的200(T8000mg/L的延伸范围依然呈现良好的总蛋白测定结果。2.镍双缩法的核心问题是络合剂。络合剂的作用就是防止镍液析出沉淀，增加镍液稳定性并延长使用寿命。如果镍液中没有络合剂存在，由于镍的氢氧化物溶解度较小，便可析出浅绿色絮状含水氢氧化镍沉淀。硫酸镍溶于水后形成六水合镍离子，如果六水合镍离子中有部分络合剂存在则可以明显提高其抗水解能力，甚至有可能在碱性环境中以镍离子形式存在。不过，pH值增加，六水合镍离子中的水分子会被OH根取代，促使水解加剧，要完全抑制水解反应，镍离子必须全部螯合以得到抑制水解的最大稳定性。但是加入络合剂使试剂中游离镍离子浓度大幅度下降，从质量作用定律看降低反应物浓度反而提高了反应速度是不可能的，因此合适的络合剂则要求它们具有较大的溶解度，存在一定的反应活性。经过研究和反复实验，发现三乙醇胺络合能力虽较差在碱性条件下较稳定，PH11-13时能隐蔽Fe、Al、Mn等，可用于乙二胺四乙酸(EDTA)对镍滴定的隐蔽齐U。符合使游离的镍离子既不能太多使产生沉淀，也不能太少而影响双缩脲显色法的速度的要求。3.黄疸尿光谱分析其色素变化规律为 I)尿液分析呈单一胆红素峰。2)尿液中出现两种吸收峰，一种吸收峰为420nm的胆红素、另一种吸收峰为492nm的尿胆素，其中胆红素为主。3)各种原因引起红细胞大量破坏，肝脏超负荷代谢，至使尿胆原、尿胆素显著增高。同时大量血红蛋白(Hb)超过结合球蛋白等结合能力，从滤膜滤出。因此除尿胆素吸收峰外，尚可见吸收峰在415nm、540nm、575nm的血红蛋白(Hb)特异吸收峰,其中以吸收峰在415nm为主。而胆红素的吸收峰在420nm与自动化分析仪的450nm相近,具有干扰作用。考虑到胆红素在碱性条件下的分解情况，本专利技术 的生化自动仪测试法中特意把含有氢氧化钠液的A试剂放在I号试剂位，与2号位的B试剂三乙醇胺分开存放，使三乙醇胺避开强碱性而更稳定，并把第I次测定点设在样品加入A试剂后Γ7分钟以用于胆红素分解，胆红素浓度〈0.07262mol/L时，对结果无影响。本专利技术产品在制备时三乙醇胺的最佳浓度在O. 05、. 07mol/L之间浓度，三乙醇胺浓度和试剂空白具有一定关系，当二乙醇胺的浓度提闻时，试剂空白也会随之相应提闻，而O. O 6 mol/L就是在确保反应速度的前提下尽可能减少空白值是最佳点。当三乙醇胺的浓度再提高时反应速度没提高而只是提高了试剂空白。使最低检测灵敏度下降。经过反复实验发现氯化钠的存在可以加快镍双缩法的反应速度，而在氯化钠达到O. 154mol/L后，则加快作用不再增加。本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种镍?双缩脲试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1）制备A组试剂：将1.0~1.4?mol/L氢氧化钠用0.14~0.2mol/L氯化钠溶液溶解得A组试剂；2）制备B组试剂：将0.05~0.07mol/L三乙醇胺、0.17~0.23mol/L柠檬酸三钠、0.015~0.025?mol/L六水合硫酸镍分别用0.14~0.2mol/L?氯化钠溶液进行溶解，然后将溶解后的三乙醇胺、柠檬酸三钠、六水合硫酸镍以3:（4~5）：（2~3）的体积比先将溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的柠檬酸三钠混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸镍混合得B组试剂；3）将A组试剂、B组试剂分别保存，使用时将A组试剂与B组试剂以4:1~6:1体积比的比例混合，得镍?双缩脲试剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：忻鼎广，
申请(专利权)人：上海市东方医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。