本发明专利技术涉及一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，介孔材料固定化蛋白，装入色谱柱，制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型，将对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂溶于缓冲液作为流动相，每隔固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分，固定次数后将流动相换成不含抑制剂的缓冲液，每隔固定时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分，所述馏分分别冷冻干燥，溶于水，用分析型色谱柱分离底物和产物，纪录产物的峰面积；绘制固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线，对模型进行验证，再采用制备的模型将待筛选中药水提物溶于缓冲液中作为流动相。根据产物的峰面积判断中药是否有抑制作用以及抑制的过程、类型。该方法具有可靠性高、在线等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种筛选中药活性成分的方法，尤其涉及。
技术介绍
药物筛选是现代药物开发过程中测试和获取特定生理活性化合物的一个步骤，是通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程。药物靶点包括基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子，近年的研究表明，酶作为药物靶点具有很多优势，且已获得了很多重要的研究成果。但是，传统利用靶蛋白为靶点进行中药筛选，一般都采用将靶蛋白与底物/中药水溶液混合孵育一段时间，利用紫外分光光度计测吸光值，从而进行抑制剂的筛选，这种方 法酶容易失活，而且筛选结果可靠度不高，且无法判断抑制类型。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，克服现有技术中采用将靶蛋白与底物/中药水溶液混合孵育一段时间，再利用紫外分光光度计测吸光值，进行抑制剂的筛选，这种方法靶蛋白容易失活，且筛选结果可靠度不高，无法判断抑制类型的缺陷。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下，包括以下步骤步骤A :制备固定化靶蛋白采用物理吸附法，将靶蛋白溶于的最适pH的缓冲液中，加入介孔材料，冰浴条件下搅拌孵育；步骤B :制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型以水为流动相，将步骤A所述固定化靶蛋白装入色谱柱中，形成固定化靶蛋白抑制剂模型；步骤C :验证步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型的有效果性；首先，选择对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂；再将步骤B制备的靶蛋白抑制剂模型连接液相色谱仪，将一定量的靶蛋白抑制剂溶于与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第一流动相；其次，开启液相色谱仪，用所述第一流动相平衡柱子，每隔固定时间进样靶靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻的出峰第一馏分；进样靶靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数后，将所述的第一流动相换成不含固定化靶酶抑制剂的与步骤A中所述缓冲液PH相同的缓冲液，每隔固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻的出峰第二馏分；最后，收集的不同时刻出峰第一馏分和不同时刻出峰第二馏分分别冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第一馏分产物及不同时刻出峰第二馏分产物的峰面积。步骤D :重复步骤A和步骤B的步骤，将步骤B制备的固定化靶酶抑制剂模型连接液相色谱仪，将与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第二流动相；开启液相色谱仪，用所述的第二流动相平衡柱子，固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物，收集不同时刻出峰第三馏分，将不同时刻的出峰第三馏分冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录的出峰第三馏分产物峰面积；所述出峰第三馏分产物为靶蛋白与底物未受抑制剂影响反应后的产物；步骤E :固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线以时间为横坐标，以靶蛋白的残余活力为纵坐标，制作随时间改变，靶蛋白经历活性被抑制和活性恢复的过程曲线；所述残余活力为不同时刻的出峰第一馏分产物峰面积或不同时刻的出峰第二馏分产物峰面积与所述不同时刻的出峰第三馏分产物面积之比；步骤F :参照上述步骤A至步骤E中的方法，将方法中的固定化靶蛋白抑制剂换成天然药物，筛选天然药物中活性成分，考察其对靶蛋白的抑制作用及抑制类型。根据试验数据绘制靶蛋白活性被抑制和活性恢复的过程曲线图的可以得知，在该浓度下，抑制剂对靶蛋白的最大抑制率；同时根据最终靶蛋白活性恢复的结果，可以得知该抑制剂是可逆抑制剂还是不可逆抑制剂。本专利技术的有益效果是本专利技术利用具有无毒无害、孔径可调、柱压低等优势的介孔材料固定化靶蛋白，装入色谱柱，利用对靶蛋白具有代表性抑制作用的靶蛋白抑制剂对模型进行验证后，在利用验证模型的方法将天然产物溶于缓冲液中作为流动相，每隔固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分，收集出峰馏分固定次数后将流动性换成不含天然产物的缓冲液，每隔固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分。通过改变流动相使靶蛋白经历抑制和活性恢复的过程。之后将收集的馏分用色谱柱分析，根据产物的峰面积判断中药是否有抑制作用以及抑制的类型。该方法具有可靠性高、在线等优点。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。进一步，所述介孔材料为羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料。进一步，所述步骤A所述介孔材料通过以下步骤制备得到步骤Al :以三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(P123)为模板剂，1，3，5-三甲基苯(TMB)为扩孔剂，I, 2-双-三乙氧基硅基乙烷(BTESE)为前导物，添加2-氰基丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅基乙烷的羧基或氨基偶联剂；步骤A2 :调节P123和TMB的比例，制备羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料(-COOH-PMOs 或-NH2-PMOsX进一步,步骤Al所述三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯和1,3，5-三甲基苯的比例为4:0到4:4。进一步，步骤A2所述羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料的孔径为8 30nm。进一步，步骤A所述冰浴条件下搅拌孵育时间为7小时。进一步，步骤C所述第一流动相平衡柱子15分钟后，每隔固定时间为20分钟进样靶蛋白的饱和浓度的底物8至12次，收集不同时刻的出峰第一馏分。进一步，步骤C所述第一流动相换成不含固定化靶蛋白抑制剂的与步骤A中所述缓冲液PH相同的缓冲液，每隔固定时间为20分钟进样靶蛋白的饱和浓度的底物8至12次，收集不同时刻的出峰第二馏分。进一步，步骤C所述固定时间进样的出峰第一馏分、出峰第二馏分及步骤D所述固定时间进样的出峰第三馏分分别冷冻干燥后溶于300ul的水溶液中，再用C18分析型色谱柱分离底物和产物。以上步骤所述的靶蛋白可以为糖尿病、心血管疾病、肿瘤和病毒的靶蛋白。附图说明图I为本专利技术中制备的固定化酶模型筛选五倍子水提物抑制及酶活恢复过程曲线图；图2为本专利技术中制备的固定化酶模型筛选红景天水溶性部位抑制及酶活恢复过程曲线图；图3为本专利技术中固定化 α -葡萄糖苷酶模型验证过程采用6mM阿卡波糖抑制固定化α -葡萄糖苷酶及酶活恢复过程曲线图；图4为本专利技术中制备的固定化酶模型筛选麦冬水提物抑制及酶活恢复过程曲线图；图5为本专利技术中制备的固定化酶模型筛选射干水溶性部位抑制及酶活恢复过程曲线图；图6为中固定化醛糖还原酶模型验证过程采用4mM依帕司抑制固定化醛糖还原酶及酶活恢复过程曲线图。具体实施例方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例I :以糖尿病靶酶α-葡萄糖苷酶为例，其底物为4-硝基苯-a-D-吡喃糖苷，典型的抑制剂为阿卡波糖。本实施例的具体过程和步骤如下I、介孔材料的制备用Ρ123为模板剂，TMB为扩孔剂，BTESE为前导物，CETES为-COOH偶联剂，通过确定Ρ123/ΤΜΒ=4/3的比例，制备孔径为13. 38nm的羧基化有机介孔氧化硅材料(-COOH-PMOs )；2、α -葡萄糖苷酶的固定利用物理吸附法，将α -葡萄糖苷酶溶于ρΗ4. 5的醋酸缓冲液，加入上述-COOH-PMOs材料，冰浴条件下搅拌孵育7h ；3、制备固定化α -葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型以水为流动相，用装柱机将上述固定化α -葡萄糖苷酶装入规格为4. 6*50mm的色谱柱中，于4°C保存；4、固定化α -葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型有效性验证室温下，ρΗ4. 5的醋酸缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A：制备固定化靶蛋白：采用物理吸附法，将靶蛋白溶于的最适pH的缓冲液中，加入介孔材料，冰浴条件下搅拌孵育；步骤B：制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型：以水为流动相，将步骤A所述固定化靶蛋白装入色谱柱中，构成固定化靶蛋白抑制剂筛选模型；步骤C：验证步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型的有效果性；首先，选择对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂；再将步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型连接液相色谱仪，将一定量的固定化靶蛋白抑制剂溶于与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第一流动相；其次，开启液相色谱仪，用所述第一流动相平衡柱子，每隔固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻出峰第一馏分；进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数后，将所述的第一流动相换成不含固定化靶蛋白抑制剂的与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液，每隔固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻出峰第二馏分；最后，收集的不同时刻出峰第一馏分和不同时刻出峰第二馏分分别冷冻干燥，溶于水，用分析型色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第一馏分产物及不同时刻出峰第二馏分产物的峰面积。步骤D：重复步骤A和步骤B的步骤，将步骤B制备的固定化靶酶抑制剂模型连接液相色谱仪，将与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第二流动相；开启液相色谱仪，用所述的第二流动相平衡柱子后，固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物，收集不同时刻出峰第三馏分，所述出峰第三馏分冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第三馏分产物峰面积；步骤E：固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线：以时间为横坐标，以靶蛋白的残余活力为纵坐标，制作随时间改变，靶蛋白经历活性被抑制或激活和活性恢复的过程曲线；所述残余活力为不同时刻出峰第一馏分产物峰面积或不同时刻出峰第二馏分产物峰面积与不同时刻出峰第三馏分产物峰面积之比；步骤F：参照上述步骤A至步骤E中的方法，将方法中的靶蛋白抑制剂换成天然药物，筛选天然药物中活性成分，考察其对靶蛋白的抑制作用及抑制类型。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴荣继，王慧亨，顾昊，胡英慧，安静，邓玉林，孟薇薇，孟世英，王丰潮，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：
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