免疫测定标准物以及利用内部测定校准标准物测量临床生物标志物制造技术

本发明专利技术提供了用于创建定量标准物以校准被分析物的新组合物和方法。这些组合物为创建用于分析被分析物和测量临床生物标志物的标准物和校准物提供了条件。还提供了包含所述新组合物用于测定，例如夹心免疫测定的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的组合物，能够在免疫测定中用作参照标准物和校准物以测量临床生物标志物。本专利技术还涉及使用所述组合物的方法和包含所述组合物的试剂盒。·
技术介绍
淀粉样蛋白β (Αβ)肽是由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)通过β分泌酶和Y分泌酶酶复合物被剪切而生成的(Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006))。β分泌酶生成这些淀粉样蛋白肽的N末端,而Y分泌酶生成C末端(Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006))。后来人们制成了数种肽，长度典型地为38-42个氨基酸不等，取决于、分泌酶在哪里切割ΑΡΡ。Αβ肽具有一个胞外域(氨基酸1-28)和一个包埋在脂双层膜内的跨膜域(氨基酸29-42)。长度为42个氨基酸的淀粉样蛋白肽(Αβ42)被认为是假定的神经毒性种类，或是单独地，或是作为聚集体。人们怀疑这些聚集体对脑的神经变性起贡献，结果导致阿尔茨海默病和痴呆。A β 42对临床痴呆起贡献的假说称为淀粉样蛋白级联假说，如Hardy等人所述(Science, 256:184-185 (1992))。Αβ肽的特征之一是在生理浓度下自组装成为寡聚体的能力(Burdick etal. , Journal of Biological Chemistry, 267:546-554(1992) ;Cerf et al. , BiochemicalJournal, 421:415-423 (2009).)。Αβ 42种类较之Αβ 4(l和Αβ 38种类更易于形成寡聚体。已经证明寡聚体形成的机制是起源于位于氨基酸16-20处的一个小的五氨基酸区域(KLVFF)，其介导Αβ肽们以反平行的方式结合。这个小区域因此得名“聚集域”(Tjernberg etal. , Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996))。在特定的条件下,尤其是在低PH范围，Αβ肽聚集体的组装很迅速(即在数分钟之内)，而在中性或更高的pH动力学则较之为慢(Burdick et al. , Journal of Biological Chemistry, 267:546-554 (1992))。聚集体在水性条件下，尤其是在盐存在下不易溶。Αβ肽的C末端藉由盐桥折叠翻过二聚体的中心，从而增加它们的疏水性并促进肽们进一步聚合形成纤丝或原纤维。Αβ42种类中额外的两个C末端残基提供较之其他的A β种类增加的疏水性(Kim et al. , Journal ofBiological Chemistry, 280:35069-35076 (2005))。临床数据提示，痴呆和认知减退与Aβ 42浓度的相关性比与Αβ 4(|或Αβ 38种类更高。该结果与Αβ42的快速聚集性质一起已经导致人们提出抑制Αβ42具体可具有临床效益的假说。已经有多项研究显示可以利用不同的机制来抑制々042聚集体的形成。Tjernberg et al. (Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996))显不，包含聚集域的肽可很好地与Αβ肽结合，并抑制聚集体的形成。还有人显示其他的几种结合聚集域的分子也可抑制淀粉样蛋白肽聚集(Martharu et al. , Journal of NeurologicalSciences, 280:49-58(2009);Kim et al. , Biochemical and Biophysical Research Communications, 303:576-279 (2003))。对聚集核心域中的氨基酸进行替代或删除整个聚集域也可防止 Αβ 聚集和原纤维形成(Tjernberg et al. , Journal of Biological Chemistry, 274:12619-12625(1999))。此外，人们已设计了多种药物来抑制Y分泌酶活性，以降低Αβ 42和相关肽种类的量。这些手段在临床上的效用目前还在研究之中。为了评估分子抑制六@42生成或防止其聚集的有效性，准确地测量Αβ42的量是必要的。有几种技术被用来对生物样品中的々042进行检测和定量，包括免疫测定(Olsson et al. , Clinical Chemistry, 51:336-345(2005);Verwey etal. , Journal of Immunological Methods, 348:57-66(2009);Sjogren et al. , Journalof Neural Transmission, 107:563-679 (2000))和基于质谱(MS)的方法(Cantoneet al., Journal of Neuroscience Methods, 180:255-260(2009);Journal of MassSpectrometry, 40:142-145 (2005))。基于质谱的方法，包括 MALDI-T0F 和 SELDI-T0F 以及液相色谱制备质谱(liquid chromatography prepared mass spectrometry)方法，能够检测生物样品中许多淀粉样蛋白β种类，但目前尚不能提供测量临床样品中的Αβ42所需的足够定量数值。免疫测定方法是基于一种双夹心免疫测定法，其包含一种对A β 42Ν末端特异性的抗体，和另一种对AP42C末端高度特异(即不识别其他Αβ肽种类)的抗体。免疫测定有两种基本形式。第一种形式藉由固定在固体表面的N末端区域特异性抗体捕捉生物样品中 的Αβ肽。向该免疫测定中加入携带有标签的八042特异性抗体以完成抗体夹心。第二种形式藉由固定在固体表面的C末端区域特异性抗体捕捉生物样品中的Αβ肽。向该免疫测定中加入携带有标签的N末端区域特异性抗体。在任何一种形式中，通过第二种抗体导入的标签容许对完整的复合物加以检测。通过使用Αβ42参照标准物(添加标准物代替生物样品)来使得这些测定定量化。用从参照标准物测量得到的信号产生标准曲线，然后用标准曲线来定量所述生物样品中Αβ42的量。迄今为止，在免疫测定中使用A β 42参照标准物都是依赖合成的全长A β 42肽，通常产生它们的难度很小。但是，这些肽具有很强的疏水性质，因此在水性溶液中不可溶。此外，Αβ 42作为参照标准物的贮存和使用都存在不少问题。如已经讨论的，Αβ 42迅速地形成聚集体，而且这种形成在室温和中性PH条件下更容易发生。在低温(-20’ C)和低pH下长期储存有助于最大程度地减小储存中的聚集，但不能防止之。在适于免疫测定的缓冲液中重溶A β 42也可能造成困难。这些溶剂几乎总是水性的，缓冲于中性pH，含有盐，并且在室温下使用。这些条件都是加速A042聚集的。由于不溶性沉淀物，以及在大小和可被检测抗体和捕捉抗体识别的性质上的不均一性，已经聚集的々042肽是无法用作免疫测定中的参照标准物的。因此，本专利技术通过提供可用于生成^42肽或其蛋白质构建物和组合物的方法，所述Αβ 42肽或其蛋白质构建物和组合物可以用作免疫测定或其他模式中的参照标准物或校准本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P赖恩，C马佩利，O王，F伯里沙，RJ尼利，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：
国别省市：