本发明专利技术公开了一种荧光分子修饰的纳米银探针。纳米银探针以直径为10~30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链和适配体链。本发明专利技术还公开了包含上述探针的试剂盒与在检测人IgE中的应用。本发明专利技术的纳米银探针耦合荧光增强液的方法能大大提高荧光检测的灵敏度，检测人IgE的线性范围宽从0.5ng/ml至10μg/ml，检测限低，特异性好。此种纳米银探针的合成及修饰方法成熟，荧光增强液廉价易得，两者的联合可以使检测人IgE的灵敏度大大提高。此种信号放大的方法为蛋白质标志物的荧光分析检测提供了一种极好的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种荧光分子修饰的纳米银探针及其试剂盒与在检测人IgE中的应用。
技术介绍
人免疫球蛋白IgE是一种和人的过敏反应密切相关的一种低丰度蛋白，监测人体内IgE的变化，对于疾病的预防和诊断具有重要的意义。常用的检测人IgE的方法有放射免疫测定法和酶联免疫法，放射免疫的缺点是费用高、时间长、放射性同位素易过期而且污 染环境，而酶联免疫法的缺点是需要使用双抗体，成本较高，双抗不易得到。适配体是具有三维空间结构能特异性识别目标蛋白质的DNA或RNA分子，合成容易，易于修饰且稳定。我们利用适配体功能化的纳米银可以实现对人IgE的特异识别。纳米银具有优良的光学特性，当荧光分子距离纳米银一定距离时(最佳距离为8nm)，纳米银能够使荧光分子的荧光信号增强，利用纳米银增强荧光的特性，我们合成了同时有适配体分子和荧光分子修饰的纳米银探针来实现对人IgE的识别与检测。我们建立了一种基于纳米银探针和荧光增强液的信号放大方法用于人IgE的高灵敏，特异性分析检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题，是提供一种灵敏的荧光增强技术并适用于人IgE检测的荧光分子修饰的纳米银探针。本专利技术还要解决的技术问题，是提供提供包含上述纳米银材料的试剂盒，用于人IgE的检测。本专利技术最后要解决的技术问题，是提供上述试剂盒在检测人IgE中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一种荧光分子修饰的纳米银探针，它以直径为l(T30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链和适配体链；其中，所述的荧光分子链为5’ -SH-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Cy5 ；其中，所述的适配体链为5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAAGGGGC ACGTT TATCCGTCCCTCCTA GTGGC GTGCCCC。上述荧光分子修饰的纳米银探针的制备方法，它包括如下步骤(I)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为I :3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(2)将荧光分子链和适配体链按摩尔比(I 99) : (I 9)加入步骤(I)得到的纳米银溶液中，静置1(T24小时，荧光分子链和适配体链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1 ；所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰，3’端由Cy5修饰；所述的适配体链，其核苷酸序列为5’AAAAA AAAAA AAAAA GGGGC ACGTTTATCCGTCCC TCCTA GTGGC GTGCC CC3，，其 5，端由巯基修饰；(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入I X PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0. 1XPBS，静置3 10小时；(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入广5mol/L氯化钠溶液，静置2 4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤广4次，使得氯化钠的终浓度为0. ro. 3mol/L ； (5)将步骤(4)得到的混合体系静置24 72小时，取上清液；(6)将步骤(5)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2 4次，IXPBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0. I飞倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。步骤(2)中，荧光分子链和适配体链摩尔比优选为(广10):(广1:10)，最优选为3:1 ;静置时间优选为15 20h，最优选为18h ;荧光分子链和适配体链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比优选为(20(T300) :1，最优选为288:1。步骤(3)中，PBS缓冲溶液优选为I XPBS，即包含如下物质的水溶液137mM NaCl，2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4. 12H20,2mM KH2PO4 ;静置时间优选为 6h。步骤(4)中，氯化钠溶液的浓度优选为2mol/L ;氯化钠的终浓度优选为0. 2mol/L ；静置时间优选为3h。步骤(5)中，静置时间优选为48h。步骤(6)中，所述的离心条件为1000(T20000rpm条件下离心10 30分钟，优选15000条件下离心15分钟。所述的I X PBSM配方为I X PBS和lmmol/L MgCl2。上述荧光分子修饰的纳米银探针在制备检测人IgE的试剂中的应用。一种用于检测IgE的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂荧光分子修饰的纳米银探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20、羊抗人IgE、人IgE、硝酸银、氢醌、牛血清白蛋白、醛基片基。上述用于检测IgE的试剂盒在检测人IgE中的应用。利用上述检测IgE的试剂盒检测人IgE含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤(I)配制溶液稀释液将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ; 洗涤液I X PBS溶液按0. 05 %的体积比加入吐温-20溶液；阴性对照将0. Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中，得lmg/ml BSA溶液；封闭液将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLl XPBS溶液中即得10mg/ml BSA封闭液；底物用lmg/ml BSA配制所需浓度的羊抗人IgE标准样品溶液；荧光增强液18. 2mmol/L硝酸银和I. 82mmol/L氢醌等体积混合；探针用(IXPBSM)溶液配制I. 3nmol/L的荧光分子修饰的纳米银探针；其中，I X PBSM 配方为 I X PBS 和 lmmol/L MgCl2。(2)将不同浓度的羊抗人IgE溶液、待测样品和阴性对照在醛基片上点样，分别为25iU，4°C条件下固定过夜；(3)每孔加入l(T200ii L封闭液，在37 °C条件下封闭广3小时，用洗涤液荡洗5 15min,洗漆3 4次,拍干；(4)在不同的孔中加入不同浓度的人IgE标准样品溶液30 ii L，在其余的孔中加入30ii L样品溶液，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3 4次，拍干；(5)每孔加入I. 3nmol/L荧光分子修饰的纳米银探针30 y L，在37°C条件下反应1^3小时，用洗涤液荡洗5 15min，洗涤3 4次，拍干； (6)每孔加入30 y L荧光增强液，避光反应f 8min，去离子水冲洗3 4遍，拍干； (7)用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同浓度的羊抗人IgE标准样品溶液对应不同的荧光信号强度，得到IgE标准曲线，由标准曲线计算得到样品中人IgE的浓度。有益效果本专利技术的纳米银探针耦合荧光增强液的方法能大大提高荧光检测的灵敏度，不需要通过改变仪器的结构来提高检测性能，巧妙地提高了检测能力。此种探针的合成及修饰方法成熟，荧光增强液廉价易得，两者的联合使用可以得到惊人的结果。为蛋白质的荧光分析检测提供了一种极好的方法。本专利技术利用适配体分子对蛋白质的特异性识别作用实现对人IgE的高灵敏特异性检测，对人IgE的分析范围为0. 5ng/ml-1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光分子修饰的纳米银探针，其特征在于，它以直径为10~30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链和适配体链；其中，所述的荧光分子链为5’？SH？AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA？Cy5；其中，所述的适配体链为：5’？SH？AAAAAAAAAAAAAAA？GGGGC？ACGTT？TATCCGTCCC？TCCTA？GTGGC？GTGCC？CC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许丹科，李慧，魏霞，羌维兵，李钟卉，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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