用于成像式荧光显微术的显微镜及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种用于成像式荧光显微术，特别是用于宽视野荧光显微术的显微镜，其具有脉冲光源(1)和成像探测器(11)，其特征在于，设有用于门控制的装置，并通过该门控制实现光源(1)和探测器(11)的同步，以达到反射光/散射光抑制的目的，从而将适宜于分析的荧光成分加以应用，而将不适宜的成分进行去除。此外本发明专利技术还涉及一种利用本发明专利技术的显微镜实施成像式荧光显微术的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于成像式荧光显微术，特别是用于宽视野荧光显微术的显微镜，其具有脉冲式光源和成像探测器。此外，本专利技术还涉及一种特别是应用本专利技术的显微镜的相应方法。本专利技术总体涉及荧光显微术，其中特别是涉及宽视野荧光显微术。
技术介绍
宽视野荧光显微术在生物和医学研究中具有重大意义。在传统的荧光显微术中试样或多或少经逐点照射，而在所谓的宽视野显微术(widefiled-microscopy)中所述试样经大面积照射，并用物镜成像，以致该整个系统的PSF(点扩展函数，Point SpreadFunction)仅由物镜的(探测)PSF决定。与此相反，在共聚焦显微镜中入射光聚焦在试样 上，以致该总PSF是照射PSF和探测PSF的乘积。较之在具有空间滤光片的共聚焦显微镜中通过探测针孔所能实现的，原则上，在宽视野荧光显微镜中有明显更多的激发光从试样反散射进显微镜的探测器的光径。然而为了能够在令人满意的条件下摄取图像，必须充分抑制散射光/反射光。为此，在宽视野荧光显微镜中通常使用抑制该相应激发波长的吸收滤光片。这通常借助于滤光立方体实现，所述滤光立方体除包含吸收滤光片(发射滤光片)外还包含用于激发光的光谱纯化的激发滤光片和作为主分光片的二向色镜，其中所述主分光片同时有助于激发滤光片和发射滤光片。但对此的缺点是，由于不变的滤光片特性，激发光的光谱调谐是不可能的。此外，在多波长激发时，必需使用在合适的光谱位置上进行透射或反射的完全特定的滤光片，这进一步限制了滤光片的灵活性，并在许多可能的光谱激发范围和探测范围里需要进行大量的滤光片组合，以至于这是不可能通过在实践中常用的滤光片轮实现的。此外，各滤光片的光谱宽度还有所制约，即该探测范围距激发波长范围必然有一定的光谱间距，从而在中间范围损失了探测光，对于显微镜更高的灵敏度来说，该探测光是应该可以探测到的。对共聚焦显微镜可示例性地参阅文献DE 199 06 757 Al。其中该探测光通常至少部分作为被校准的光束而穿过针孔。相应地可使用声光部件。与此相反，在宽视野显微镜中，在视野镜组中存在真实图像，这表明光在许多可能的空间角度中同时入射，这使得相应的声光部件的使用似乎反而没什么意义，甚至完全不可能。这归因于所述声光部件需要极大的光孔，因此会特别复杂且昂贵。在文献US 5252834中公开了显微镜中的门控制,但不用于成像和完全不适用成像中的反射光抑制/散射光抑制。但其中涉及逐点光谱摄像试样的化学组成的特性测定(显微分光光度术)。其中未提供成像探测器。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，在适用于宽视野荧光显微术的成像式荧光显微镜中，利用简单的装置实现反射光抑制/散射光抑制，用以因此在令人满意的条件下摄取可再现的图像。对此所需的措施应可用简单的装置成本低廉地实现。上述关于本专利技术的显微镜的目的是通过权利要求I的特征部分实现的。上述关于本专利技术的方法的目的是通过从属权利要求18的特征部分实现的，更确切地说是利用本专利技术的显微镜。关于本专利技术的显微镜，其基本目的是如此实现的，即设有用于门控制的装置，并通过该门控制实现光源和探测器的同步以达到反射光抑制/散射光抑制的目的，从而对适宜于处理的荧光成分加以利用，而对不适宜的成分予以舍弃。本专利技术的方法是相应地为此设计的。本专利技术的方法提出对显微镜中的成像探测器结合脉冲光源进行门控制。然而目前在显微术中主要使用的照相机不允许进行门控制，甚至不对所有像素同时进行，因为通常是通过共同的读取寄存器进行按序读取。通常也不允许使用具有单光子灵敏度的CMOS芯片，因为尽管可以利用其进行并行读取，但该读取过程在亚IOOns范围内对适用的门控制 来说实在是太慢了。基于本专利技术，优选将以盖革模式运行的雪崩光电二极管的阵列(APD阵列；其中这种APD有时也被称为“硅光电倍增管”)用于成像设备，所述成像设备允许进行门控制的，并可借助它实现本专利技术的反射光抑制/散射光抑制。原则上也可以考虑其它适于“可门控制的照相机”的可能性。本专利技术基于利用脉冲光源和成像探测器进行工作的荧光显微镜。考虑到荧光的衰变时间，当脉冲光源所具有的脉冲宽度在荧光团的寿命范围内或更好地低于此范围时，对于脉冲光源是有利的。基于通常的荧光染料，脉冲宽度在5ns范围内，优选在Ins范围内，更优选在200ps范围内是有利的。光源可以是激光器、LED、闪光LED或可被激发激光的放大介质等。如果该光源可触发则更是特别有利的，其中这一点对于本专利技术技术方案的实施不是必不可少的。在特别有利的方式中，可应用脉冲式白光激光器、脉冲式LED、脉冲式OPO和其它脉冲式激光器。使用可门控制的成像探测器，换言之“可门控制的照相机”进行探测。其可以是预接具有经某种改制的可触发的/可门控制的光学快速快门的照相机，或是可门控制地激活/去活的成像探测器。也可利用在产生探测信号后提供相应信息的成像探测器，该信息表明是否应处理或弃去相应的信号成分。可门控制的光学快门可以是例如可快速控制的光学图像放大器，所述图像放大器在关闭状态下不增强光，而在接通状态下增强光；也可以是可饱和的光学吸收器，所述光学吸收器通过短的光脉冲而饱和，并由此在施加门控制时变成透明的。可门控制的探测器可基于以盖革模式运行的雪崩光电二极管(APD)中的阵列实现。为此，该成像探测器的每个单个像素均由单个以盖革模式运行的APD阵列组成或由其中多个阵列组成(=子阵)。通过施加合适的门电压开启单个APD的盖革模式，由此实现入射光子能够触发对APD的击穿，并产生相应的电子信号。只要门控制关闭，该状态就不会发生，以致此时该探测器是去活的。也可考虑门控制的其它实现可能方式，例如与此相反的，所述探测器的输出端在门控制的断开时间中短路或针对信号支路中断。类似的可由外部控制的门控制也可在其它的照相机类型如CMOS芯片或CXD芯片中实现。原则上不一定需要在门控制断开状态下抑制信号的产生。“保存”相应的时间信息就足够了。在极端情况下，对每个单个光子赋以时间标记，即对每个单个光子的到达时间予以存储就足够了，用以在下游的数据处理设备(现场可编程序门列阵(FPGA)、数字信号处理设备(DSP)及其他)中判定是否应处理该光子或舍弃该光子。这并不是对每个单个光子所必须进行的。原则上对每个像素录下时间信号分布或其一部分，并随后加以处理就足够了。前述所讨论的技术之间的转换方式不是一成不变的，特别是由于当今日益增强的集成电子技术。重要的是，该成像设备是可门控制的，其中对所有像素优选存在一致的(同时的)门控制，尽管在特定情况下，也可考虑不同的时间门位置(temporal gatepositions)。富于独创性的关键的一步在于，该可门控制的成像设备与脉冲光源是同步的，从而在处理中可再现性地利用适宜的荧光成分，而舍弃不适宜的成分。优选将属于目标荧光 的光成分通过适宜的门控制用于成像，也就是说，如所实现的那样彼此相互独立。属于反射光或散射光的成分被舍弃。在某些情况下有意义的是，在照射后对可自由调节的时间范围内的荧光加以使用，而舍弃其它的光，或者将其归入或输入至少一个其它的探测通道。这对试样来说是至关重要的，对试样来说能够通过荧光寿命推测试样内部的局部情况。为应用本专利技术的设想，该成像探测器即“照相机”仅需将其门控制与光源有效地同步。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于成像式荧光显微术，特别是用于宽视野荧光显微术的显微镜，其具有脉冲式光源(1)和成像探测器(11)，其特征在于，设有用于门控制的装置，并通过该门控制实现光源(1)和探测器(11)的同步来达到反射光抑制/散射光抑制的目的，从而对适宜于处理的荧光成分加以利用，而对不适宜的成分进行舍弃。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：V·塞弗里德，
申请(专利权)人：徕卡显微系统复合显微镜有限公司，
类型：发明
国别省市：