一种检测人血管内皮生长因子（VEGF）的发光检测试剂盒。试剂盒盒体内包括：VEGF受体包被的固体反应板、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体加保护剂配置的酶结合物、VEGF标准品、样品稀释液、PBST浓缩洗液、鲁米诺配置的发光底物、封板胶纸。本试剂盒可用于癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎的诊断和预后，具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体地说涉及一种检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的发光检测试剂盒。
技术介绍
肿瘤的发展和转移是多阶段的、复杂的、具有高度选择性的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，其机理尚不甚清楚。近年来关于新的血管生成与肿瘤发展、转移和预后关系的研究进展迅速，证明新的血管生成是肿瘤生成、转移和转移灶生长的必要条件，血管内皮细胞生长因子(VEGF)是调节新血管生成的最重要的细胞因子。研究表明血管内皮细胞生长因子(VEGF)在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用(Ferrara et al.Endocr. Rev. 1997, 18:4-25)。 VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，有两个相同亚单位通过二硫键结合形成，等电点为8. 5，有很强的耐热和耐酸能力。人VEGF基因有5种不同的异构体，分别为 VEGF206、VEGF189, VEGF165、VEGF145, VEGF121。VEGF高亲和力结合位点仅位于血管内皮细胞上的3种VEGF受体，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，这3种受体主要分布于血管内皮细胞表面，均是跨膜受体。研究表明，VEGF受体在体外与VEGF有高度的亲和力(Kendall et al. PNAS USA, 1993，90:10705-9)。VEGF是癌症生长、转移所必需的一种因子。目前研究表明，在人类各种恶性肿瘤(即癌症)疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性。有大量文献报道，VEGF在正常人和癌症患者中的浓度明显不同，正常人中的VEGF浓度很低或检测不到，而在癌症患者中VEGF浓度很高。因此，检测人血液中的VEGF浓度，能够用于癌症的早期普查诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF的血液浓度就高；而当肿瘤因化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。故VEGF得检测可作为疗效观察和预后的指标。VEGF是恶性肿瘤诊断中的一个重要组成部分。另外，血液VEGF水平增高亦见于糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。化学发光免疫测定(chemiluminesent immunoassay, CLEIA)是免疫测定技术继酶免技术、放免技术、突光免疫技术和时间分辨突光免疫技术之后发展的一项新兴测定技术。其基本原理是将化学发光系统与免疫反应相结合，以检测样本中的抗原或抗体，由于它既具有免疫反应的高度特异性，又具有发光反应的高敏感性，近年来已被国内外临床实验室及科研单位，广泛应用于各种激素、特种蛋白及药物的监测和分析。该方法具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快捷、标记物稳定、无污染、仪器简单经济等有点。目前，用过氧化氢和辣根过氧化物酶(HRP)联合催化鲁米诺类化合物发光的化学发光免疫测定效果比较好，应用比较广泛
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的化学发光检测试剂盒。该试剂盒结果准确稳定、特异性强、灵敏度高、使用方便、便于推广。本专利技术的另一目的是提供上述发光检测试剂盒的生产制备及使用方法。为实现上述目的，本专利技术提供的试剂盒组成为 I.反应板；2.酶结合物；3.标准品；4.样品稀释液；5.浓缩洗涤液；6.发光底物Α、Β;7·封板胶纸。 本专利技术提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下 (a)以固体反应板为固体支持物,将VEGF受体包被于固体支持物上； (b)用封闭液封闭； (c)将生物标本与固定于固体反应板上的VEGF受体接触和保温，生物标本中的VEGF特异地与VEGF受体结合； (d)从VEGF受体上分离生物标本； (e)用辣根过氧化物酶(HRP)标记的VEGF单克隆抗体检测VEGF，所用的发光底物为鲁米诺溶液。本专利技术试剂盒的独特性在于，它使用VEGF受体包被反应板，能够确保VEGF能被本试剂盒所检测，能对标本有准确的测定。本试剂盒检测生物标本中的VEGF，优选来自癌症、血管病病人的标本。具体实施例方式下述实施例是为了更详细的解释本专利技术，但不应理解为本专利技术局限于此。实施例I : 本专利技术的试剂盒举例可以是下列物质 (1)VEGF受体包被反应板； (2)酶结合物辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子单克隆抗体，I瓶； (3)VEGF标准品，2支; (4)样品稀释液0.05%吐温-20，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二钠，O. 05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5，l 瓶;(5)浓缩洗涤液为137mMNaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 , O. 05% 吐温-20，Ph7. 4, I瓶； (6)发光底物A、B，其中A液为H2O2溶液，B液为鲁米诺溶液，各I瓶； (7)封板胶纸2张。本例所述的各种物质量均以反应板为96孔(12条8孔或8条12孔)的例子计算的，如果反应板的孔数多于或少于96孔，则各物质量也相应或多或少。其制备方法 (I)VEGF基因和VEGF受体基因的克隆 以人胎盘cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。依据VEGF基因的报道序列设计引物，PCR反应条件94°C变性40秒，52°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，30个循环后72°C保温10分钟。依据VEGF受体基因的报道序列设计引物，PCR反应条件94°C变性40秒，52 °C退火I分钟，72 °C延伸2分钟，30个循环后72°C保温10分钟；反应体系 ddH2020. 0 μ I IOXBuffer2. 5 μ I dNTP(IOmM)O. 5 μ I 3 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I 5 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I Taq 酶(5U/μ I)O. 5 μ I 模板 NDAO. 5 μ I 总体积25 μ I 凝胶电泳回收PCR扩增的片段，克隆到载体ΡΜΤ18-Τ中，转化大肠杆菌DH5 α，提取重组质粒进行酶切鉴定。VEGF基因的重组质粒命名为pMT18-l，VEGF受体基因的重组质粒命名为pMT18-2。DNA序列分析由上海博亚生物工程有限公司完成。(2)昆虫表达载体的构建 用Sal I ,BamH I分别酶切质粒pMT18_l和pMT18_2，分别回收VEGF基因片段和VEGF受体基因片段。同时用Sal I > BamH I酶切质粒pFastBac-HT，回收4.7kb片段。将VEGF基因片段和VEGF受体基因片段分别与4. 7kb片段进行连接，构建载体pFastBac-1和pFastBac-2。用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定，表明所构建载体正确； 分别将载体PFastBac-I和pFastBac_2转化DHlOBac感受态细胞。采用蓝白斑筛选，24小时后将白斑划到新平板上，确认其是否白斑。将菌落挑到2ml LB培养基中，37°C，250rpm振荡培养12小时； 提取培养的菌液中的质粒方法如下 (a)将1.5ml菌液转入离心管中，10，OOOrpm离心30s，弃上清，将离心管倒立于纸巾上，使细菌沉淀尽可能干燥； (b)加300 μ I 溶液 I (50mM 葡萄糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发光检测试剂盒，其组成为：反应板、酶结合物、标准品、样品稀释液、浓缩洗涤液、发光底物A、B和封板胶纸；其中：反应板为血管内皮细胞生长因子受体包被的固体反应板；酶结合物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子单克隆抗体？。
【技术特征摘要】
1.ー种发光检测试剂盒，其组成为 反应板、酶结合物、标准品、样品稀释液、浓缩洗涤液、发光底物A、B和封板胶纸； 其中 反应板为血管内皮细胞生长因子受体包被的固体反应板； 酶结合物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子单克隆抗体。2.权利要求I的试剂盒，其特征在于 标准品为血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉； 样品稀释液为0. 05%吐温-20，1%牛血清白蛋白，IOmMこニ胺四こ酸ニ钠，0. 05%硫柳汞，0. 4M NaCl，pH6. 5; 浓缩洗涤液为 137mM NaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mMKH2P04，0. 05% 吐温-20，Ph7. 4 ； 发光底物A、B，其中发光底物A为H2O2溶液，发光底物B为鲁米诺溶液。3.权利要求I的试剂盒，其特征在于，各物质的量以反应板的孔数为标准。4.权利要求I的试剂盒，其特征在于，所述反应板为96孔。5.上述试剂盒的制备和操作方法，主要步骤为 Ca)将血管内皮细胞生长因子受体包被于固体支持物固体反应板上； (b)用封...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹检平，
申请(专利权)人：北京健平九星生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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