基于芯片纳流液相色谱/质谱的类黄酮代谢轮廓分析方法技术

本发明专利技术公开了一种大豆类黄酮代谢轮廓分析的芯片纳流液相色谱/质谱方法，采用简单的样本预处理方法，在高富集容量芯片及优化的分离分析条件下，微小进样量即可实现73种黄酮类化合物的轮廓分析。本发明专利技术的分析方法简单、快速，样本用量小且重复性好，适合于实际样本的批量分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析化学领域，是ー种基于芯片纳流液相色谱/质谱联用(LC-Chip/MS)的大豆类黄酮代谢轮廓分析的方法。
技术介绍
现代分析化学发展的ー个重要方向就是发展微量化、集成化的分离分析新方法。为了提高分析的灵敏度和通量，降低分析成本和样本消耗量，发展微量化、集成化的分析方法已成为当前研究的前沿领域。纳流液相色谱技术是上世纪九十年代发展起来的ー门技术，因其具有样本消耗小、分析速度快和易集成化的优点吸引了研究者的广泛关注，成为微型化分析领域中的研究热点。最近出现的芯片纳流液相色谱/质谱系统(LC-Chip/MS)把纳流液相系统的样本浓缩和分离功能与电喷雾质谱仪中使用的复杂连接和喷雾器无缝地整合在一起，大幅度降低了泄漏和系统无效体积，简化了工作流程，提高了分析的灵敏度和 可靠性。目前LC-Chip/MS技术已被用于蛋白质组、寡糖等研究，其易操作、灵敏度高及样本消耗量少的特点在代谢组学研究方面亦有很大优势，但迄今为止基于LC-Chip/MS的代谢组学轮廓分析技术鲜见报道。类黄酮是广泛分布于植物中的一大类衍生化合物，目前已知的类黄酮化合物有3000-4000种，其中食品中的主要类黄酮大致分为四类，分别为黄烷酮、黄酮、黄酮醇和异黄酮。目前研究较多的是大豆中的异黄酮，其作为大豆生长过程中的一类次生代谢产物，因具有预防癌症、心血管疾病及骨质疏松症等生理功能而备受关注。除异黄酮外，大豆中的其他黄酮类化合物也具有不同的生理功能，如对其含量及分布进行研究，并与代谢途径相关联，则可以获取更加全面、完整的信息。到目前为止，对大豆中黄酮类物质分析的文献报道大都局限于测定某几个黄酮类代谢物或水解后的总黄酮含量，仅有的几篇轮廓分析的报道也需要二次提取及纯化过程。而相对快速的提取及分析不仅可以减小人力物力的消耗，而且可以大大提高分析的通量。LC-Chip/MS分析系统作为仪器微型化的代表，除可以减小进样量外，其关键组成部分-芯片也具有较强的灵活性，我们采用订制的高富集容量芯片不仅可以大幅度提高检测灵敏度，简化样品预处理过程，在优化的分离分析条件下还可实现更多黄酮类化合物的分离分析。该方法具有操作简单、灵敏度高的优点，可对不同种植环境及遗传背景的大豆样本进行分析为大豆类黄酮的进ー步研究提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立ー种大豆类黄酮代谢轮廓分析的芯片纳流液相色谱/质谱方法，使预处理过程更为简单，样品用量更少，并可获得更多黄酮类代谢物信息。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下—种大豆类黄酮代谢轮廓分析的芯片纳流液相色谱/质谱(LC-Chip/MS)方法(I)加入提取液的大豆种子样本超声离心后，上清液直接上样分析，样品预处理过程简单，无须富集等预处理过程；(2)上清液直接上样分析，采用高富集容量芯片及优化的分离分析条件，可实现更多黄酮类化合物的轮廓分析，I U L样品在22分钟内可获得大豆中73种黄酮类化合物的代谢轮廓；高富集容量芯片由500nL大容量富集柱、长150mm分析柱及喷针组成，富集柱及分析柱的填充材料均为Zorbax SB-C18 ;富集柱和分析柱通过六通阀相连，喷针固接于分析柱的一端。具体步骤如下，(I)称取一定量的大豆种子样本 于玻璃管中，向每支管中加入含内标柚皮素、异槲皮苷及芦丁各0. 5-2 u g/mL的提取溶剂(含甲醇10-30%的水溶液)，超声10-20分钟后离心，将上清液移至进样瓶中用于芯片纳流液相色谱/质谱联用分析。(2)LC-Chip/MS分析方法的具体參数为本分析最终选用的是高富集容量芯片，该芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75iim)、分析柱(75 y mX 150mm)及喷针(10 y m ID)组成，富集柱及分析柱的填充材料均为Zorbax SB-C18 (5 y m)。富集柱和分析柱通过六通阀相连，富集柱的两端分别与六通阀的接ロ①④相连，分析柱的一端与六通阀的接ロ③相连，喷针固接于分析柱的另一端，六通阀的接ロ②作为流动相端、其通过nano泵与流动相A和B相连，六通阀的接ロ⑥废液端、即废液出ロ端，六通阀的接ロ⑤作为试样端、其通过毛细管泵与洗脱液和试样存储容器相连。富集时，芯片通过毛细管泵接通试样端和废液端引入试样存储容器中的样品并在富集柱上实现富集，此时六通阀的接ロ⑤、④、①、⑥依次连通，试样端洗脱液为含体积2%的こ腈水；样品分析时，通过nano泵接通流动相端和分析柱，样品进入分析通道，此时六通阀的接ロ②、①、④、③依次连通；分析流动相A为含体积0. 1%甲酸的水溶液，B为含体积0.I % 甲酸的 ZJ青；梯度洗脱条件=Omin 时 90/10 (A/B, V/V)，13min 时 70/30 (A/B, V/V)，18min 时 5/95 (A/B，V/V)并保持 4min，22. Imin 时 90/10 (A/B，V/V)，随后起始梯度 90/10 (A/B，V/V)平衡8min ;其中0_13min为第一段线性梯度洗脱、13_18min为第二段线性梯度洗脱，18-22. Imin为第三段梯度洗脱；毛细管泵的流速为4-6 V- L/min, nano泵的流速0. 3-0. 6 u L/min ;进样量为0.1-1 U L，进样后富集柱冲洗体积为3-4 y L ;分析柱的柱后流出液未经分流导入质谱系统检测；质谱条件为电喷雾离子源，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度300°C，干燥气流速为4L/min ;毛细管电压为1800-1900V ;Centroid模式采集质谱数据；质量扫描范围m/z 100 1000 ;在上述条件下可获得大豆类黄酮的代谢轮廓谱，即大豆类黄酮LC-Chip/MS分析的TIC图(图I)。本专利技术具有的效果是样本的储存、预处理及分析均采用自主建立的标准化程序，避免引入人为误差。所采用的预处理过程简单，不需要二次富集及纯化，可避免目的化合物的部分损失，同时减小了预处理过程误差，保证了分析方法的稳定性。采用微型化分析仪器及自主订制的高容量富集芯片，在优化的分析条件下节省了分析时间和样品用量，提高了分析通量，与预处理过程相结合可鉴定更多的目标化合物。另外，采用不同类型的内标及质量控制样本校正预处理过程和实验中仪器响应微小漂移带来的误差，进ー步确保了该方法的稳定性。对样本中9个特征离子的方法重复性考察结果见表1，其相对标准偏差为I. 50-7. 66%,进ー步证明了本专利所阐述方法的稳定性。附图说明图I大豆类黄酮LC-Chip/MS分析的TIC图(A)及典型离子的EIC图⑶。图2不同种植地点大豆样本的PLS-DA得分图。每个点表示ー 个样本，t表示样本在主成分投影值。 :种植地点济南，▲:种植地点吉林。 图3为本专利技术中高富集容量芯片结构示意图。图中I洗脱液，2废液，3富集柱，4流动相，5分析柱，6喷针。具体实施例方式实施例II.大豆种子样本采集5个大豆品种分别为吉育73、长农16、九农30、荷豆12、中黄13。其中吉育73、长农16和九农30的种植地点为吉林。荷豆12和中黄13的种植地点为济南。大豆种子样本采集后放在_80°C冰箱保存。2.分析方法2. I大豆种子样本预处理大豆种子样本从_80°C冰箱中取出，在干燥器中等本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于芯片纳流液相色谱/质谱的类黄酮代谢轮廓分析方法，其特征在于：(1)加入提取液的大豆种子样本超声离心后，上清液直接上样分析；(2)上清液直接上样分析，高富集容量芯片分离分析条件：高富集容量芯片由500nL大容量富集柱、长150mm分析柱及喷针组成，富集柱及分析柱的填充材料均为Zorbax？SB？C18；富集柱和分析柱通过六通阀相连，喷针固接于分析柱的一端。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春霞，常玉玮，吴泽明，路鑫，周佳，许国旺，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：