本发明专利技术适用于微生物技术领域，提供了一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括DNA提取液、PCR反应液。本发明专利技术金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒及检测方法能同时检测金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种。
技术介绍
金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌的别称，是革兰氏阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌致病力强弱主要取决于其产生的侵袭性酶和毒素，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。能引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、 热、肾小球肾炎等变态反应。国际上通用的金黄色葡萄球菌采用培养检测如下(I)样品处理无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成KT1稀释液。(2)增菌培养将KT1稀释液接入7. 5% NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。(3)分离培养将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24 48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形,直径2 3mm,颜色灰或黑色,周围有一浑池带。⑷染色观察从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0. 5 I i! m。(5)血浆凝固酶试验吸取0. 5mL兔血浆与0. 5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。(6)耐热核酸酶试验将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36± I°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。国际上通用的溶血性链球菌采用培养法检测如下(I)样品处理取25g固体(或25mL液体)检样加入225mL灭菌生理盐水，制成混悬液。(2)分离培养吸取5mL混悬液接种至50mL葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线于血平板(如检样污染严重，可同时接种5mL至匹克氏肉汤)，36°C培养24h，接种血平板，36°C培养24h，挑起こ型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，观察在液体和固体中的培养特征、溶血情况及革兰氏染色、形态，并进行链激酶试验和杆菌肽敏感试验。链激酶试验吸取草酸钾血浆0. 2mL，加0. 8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入链球菌18 24小时36°C肉浸液肉汤培养物0. 5mL及0. 25%氯化钙0. 25mL,混匀，置于36°C水浴lOmin，血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24小时后不溶解即为阴性。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。杆菌肽敏感试验取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有 0. 04单位的杆菌肽纸片置于上述平板上，36 °C培养18 24小时，如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照。根据上述通用方法，同时检测样品中金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌这两种细菌的周期长(至少48小吋)、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂(生化试验试剂和血清)繁多等缺点已远远不能满足快速检测金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的要求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供ー种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，解决现有技术中同时检测金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌灵敏的低，周期长等技术问题，以及金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的检测方法。本专利技术是这样实现的， ー种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液包括金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针、溶血性链球菌第一引物、溶血性链球菌第二引物、溶血性链球菌探针，所述金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ ID N01所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO 2所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQID NO :3，溶血性链球菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，溶血性链球菌第二引物序列如SEQ ID NO :5所示，溶血性链球菌探针序列如SEQ ID NO :6所示。本专利技术进一歩提供ー种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测方法，包括如下步骤提供金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的DNA样品；进行荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用前述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒。 本专利技术能同时检测金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌，不用对待测样品进行长时间的增菌培养，同时加入有检测引物和探针，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的检测。附图说明图I是本专利技术实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒中阳性对照PCR扩增图；图2是本专利技术实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒阴性对照PCR扩增图；图3是本专利技术实施例一金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试方法中阳性样本PCR扩增图；图4是本专利技术实施例一金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试方法中阴性样本PCR扩增图。具体实施方式 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。本专利技术实施例提供一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液,所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石腊,所述第一反应液包括金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针、溶血性链球菌第一引物、溶血性链球菌第二引物、溶血性链球菌探针，所述金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ ID NO :1所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQ ID NO :3，溶血性链球菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，溶血性链球菌第二引物序列如SEQ ID NO :5所示，溶血性链球菌探针序列如SEQ ID NO :6所示。具体地，本专利技术实施例金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其中包括DNA提取液、PCR反应液，可以同时进行金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的检测，该试剂盒中还包括金葡-溶链(即金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌)阴性对照及阳性对照。试剂盒的规格为阴性对照为I管，40iU/管，阳性对照为I管，40iU/管，DNA提取液为5ml/管(共I管)，P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液包括金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针、溶血性链球菌第一引物、溶血性链球菌第二引物、溶血性链球菌探针，所述金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ？ID？NO：1所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ？ID？NO：2所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQ？ID？NO：3，溶血性链球菌第一引物序列如SEQ？ID？NO：4所示，溶血性链球菌第二引物序列如SEQ？ID？NO：5所示，溶血性链球菌探针序列如SEQ？ID？NO：6所示。
【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液包括金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针、溶血性链球菌第一引物、溶血性链球菌第二引物、溶血性链球菌探针，所述金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQID NO: I所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQ ID NO :3，溶血性链球菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，溶血性链球菌第二引物序列如SEQ ID NO :5所示,溶血性链球菌探针序列如SEQ ID N0:6所示。2.如权利要求I所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液还包括灭菌超纯水、缓冲液、氯化镁、dNTPs。3.如权利要求I所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液包括Taq酶、灭菌超纯水及显色剂。4.如权利要求I所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液和第二反应液通过所述石蜡分隔开。5.如权利要求3或4所述的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述第一...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢柳燕，龚剑，田仁鹏，吴成贡，汪再兴，黄娟，
申请(专利权)人：深圳市生科源技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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