一组肝癌血清核酸适配子制造技术

一组肝癌血清核酸适配子，属生物医学检测分析技术领域。本发明专利技术公开了9个以肝癌血清为靶标筛选出的肝癌血清核酸适配子的核酸序列，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度测定方法分析了它们与肝癌和非肝癌血清标本的结合程度，显示每个核酸适配子对肝癌均具有良好的诊断价值，受试者工作特征曲线下面积达0.894~0.949，鉴别肝癌与非肝癌患者的准确度达84.4%~91.4%。这些核酸适配子可直接或修饰后应用于肝癌血清标本的分析，为肝癌的临床诊断、治疗和预后判断提供实验依据，也可应用于建立基于核酸适配子的肝癌检测新技术，具有良好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本项专利技术属生物医学检测分析

技术介绍
核酸适配子(aptamer)是一种生物祀分子的人工单链寡核苷酸配体,通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子筛选的基本步骤如下设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核酸，以洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-洗脱-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将从文库中筛选出来并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测 序，其中长度及两端序列与文库相符者即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点①高特异性和高亲和力核酸适配子能够分辨出靶分子结构上细微的差别，亲和力甚至强于天然配体；②靶标广泛从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选核酸适配子的靶标；③稳定性好核酸适配子可长期保存，通过人工合成而无批间差异，可在常温下运输；④改建和修饰容易可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换应用优势核酸适配子无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。核酸适配子在人类疾病的诊断方面显示出良好的应用前景。Golden等用核酸适配子检测碱性成纤维生长因子(bFGF)，其敏感性高于商业化ELISA试剂盒近20倍，且特异性良好。Liu等用核酸适配子纳米传感器可以快速、敏感、特异地检出循环血液中的肿瘤细胞。McCauley等研制出核酸适配子型生物传感器阵列，能特异且定量检测出与血清或细胞提取物混合的3种肿瘤标记物。Hicke等用放射性核素标记黏韧素-C的核酸适配子，成功应用于人胶质母细胞瘤和乳腺癌动物模型的肿瘤显像。原发性肝癌(下称肝癌)是常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。近年来肝癌的治疗手段有了长足的进步，但是5年生存率仍不理想。据国内大样本多中心临床资料统计显示，住院肝癌患者的5年生存率只有32. 5%，晚期肝癌I年生存率仅14. 7%，3年生存率为0. 3%，5年生存率为0，而早期肝癌患者及时治疗后，1、3、5年生存率分别达到93. 5%、70. I %和59. I %。因此，尽早诊断与尽早治疗是目前改善肝癌患者预后最有效的手段，探索与建立有效的肝癌诊断新方法具有十分重要的意义。目前影像学检查是肝癌定位诊断的主要依据，血清标志物检测是肝癌定性诊断主要的依据。影像学诊断肝癌后，还需要进一步检测肝癌血清标志物进行印证，对于影像学诊断困难的小肝癌，标志物检测是唯一的无创性诊断手段。血清标志物具有易检测、可重复、侵入少的特点，在肝癌的诊断中占有重要的地位。甲胎蛋白(AFP)是目前全世界应用最广泛的肝癌血清标志物，已经用了数十年，但其敏感性(40%飞5%)、特异性(769Γ9690并不理想。因此，寻找更加特异、更加灵敏的肝癌血清标志物一直是各国学者的研究热点。筛选肝癌特异的核酸适配子，籍于其在诊断应用方面的优势，为肝癌诊断建立更为特异和敏感的方法，对于提高肝癌的诊疗水平具有十分重要的价值。
技术实现思路
本专利技术的目的寻找一组具有应用价值的肝癌血清核酸适配子，可作为分子探针应用于肝癌的检测分析，为肝癌的临床诊断、治疗和预后判断提供有重要价值的生物信息。本专利技术采用的技术方案采用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度测定技术，对通过SELEX技术筛选并初步鉴定价值较大的一批肝癌血清核酸适配子进行分析，评估它们对肝 癌的诊断效率，确定其中有重要应用价值的核酸适配子。本组肝癌血清核酸适配子应用价值分析的步骤和主要结果如下。a.收集受试者的血清标本收集诊断明确的肝癌、肝硬化、乙型肝炎及正常人的非抗凝外周血标本并分离血清。随机选取1(Γ20例肝癌血清标本等量混合制备肝癌混合血清，同法制备正常混合血清。b.筛选肝癌血清核酸适配子设计并合成随机单链寡核酸文库[5' -ACCGACCGT GCT GGA CTC T (N40) ACT ATG AGC GAG CCT GGC G-3/ ]及其配套的引物(上游引物5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3';下游引物5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAGT-3');将文库与正常混合血清孵育，分离纯化不与血清结合的核酸并进行不对称PCR扩增，制备出新的文库用于下一轮筛选；将第3轮筛选后制备的文库与肝癌混合血清孵育，分离纯化与血清结合的核酸并进行不对称PCR扩增，制备出新文库用于一下轮筛选；以第9轮筛选后制备的文库为模板进行对称PCR扩增，将扩增产物送生物工程公司克隆、测序，分离出单个核酸适配子；应用RNA Structure 4. 6软件模拟分析各核酸适配子的二级结构,应用Clustal X软件对各核酸适配子进行同源性分析和家族划分，从各家族中选出代表性核酸适配子；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度分析技术分别测定各代表性适配子与肝癌混合血清和正常混合血清的结合程度，优选出能与肝癌混合血清特异性结合的核酸适配子。c.合成肝癌血清核酸适配子将步骤b优选出的能特异性结合肝癌混合血清的核酸适配子，送生物工程公司合成，用结合缓冲液配制成核酸适配子溶液。d.确定核酸适配子用量取最小量为2pmol的等差梯度量的步骤c配制的核酸适配子溶液，进行常规凝胶电泳和核酸染色，采集紫外滤光图像并使用凝胶分析软件测定核酸适配子带的灰度值，以灰度值保持在线性范围内的最大摩尔量确定为核酸适配子用量。e.确定血清标本用量以步骤d确定的核酸适配子用量与最小量为2 μ I的等差梯度体积的肝癌混合血清混合孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，并采集紫外滤光图像。凝胶图像上可见结合核酸适配子带和游离核酸适配子带，使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，以灰度值保持在线性范围内的最小灰度值者所对应的标本体积确定为标本用量。f.标本检测及灰度测定以步骤d确定的核酸适配子用量和步骤e确定的血清标本用量为条件，将核酸适配子分别与肝癌、肝硬化、乙型肝炎、正常人的血清标本混匀后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，采集紫外滤光图像并使用凝胶分析软件测定各标本的游离核酸适配子带的灰度相关指标。同时每块凝胶均以结合缓冲液代替标本做一孔适配子对照。g.核酸适配子与血清的结合程度分析导出步骤f测定的各标本核酸适配子游离带的灰度值(INT)、平均灰度值(INT/mm2)及其标准差3个指标的数据，并进行统计分析。在所分析的12个核酸适配子中，肝癌组灰度值明显小于非肝癌组的核酸适配子见表I。表I 肝癌血清核酸适配子与肝癌和非肝癌血清标本的结合情况本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组肝癌血清核酸适配子，其特征在于具有下列核苷酸序列：（1）AP？HCS？9？10：5’？ACCGACCGTGCTGGACTCTATGGGCCTGGGCCGTGCAGTTAG？CTCGGCGGTGTATTGTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’（2）AP？HCS？9？74：5’？ACCGACCGTGCTGGACTCTTGACCTAAGTTAGTGGTCCTGTT？GATGGTTCGTGTGGTTGAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’（3）AP？HCS？9？89：5’？？ACCGACCGTGCTGGACTCTACAGAGTGCTTGATCTCGGGTT？GTCGGTGTCGGTGGACTGAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’（4）AP？HCS？9？132：5’？ACCGACCGTGCTGGACTCTAGGAGGGTGATGCAAATGGAC？GTTCAGATTAGTGTGGTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’（5）AP？HCS？11？3：5’？ACCGACCGTGCTGGACTCTATGGAATGGATCGTTCTGTGTCG？GGTCGTACGGGAGTGTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’（6）AP？HCS？11？4：5’？ACCGACCGTGCTGGACTCTATAGGCCGTTGATGCGCGGGAG？GGTCGTTCGTAATGATTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’（7）AP？HCS？11？5：5’？ACCGACCGTGCTGGACTCTATGAGCAGGGACATAGGGACGG？TGTTTGGGAGTGGATTACAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’（8）AP？HCS？11？6：5’？ACCGACCGTGCTGGACTCTTACACGCATTTGGTGATGTGTCA？AGGTCAGTTCTGTGGGTAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’（9）AP？HCS？11？10：5’？ACCGACCGTGCTGGACTCTAGGGCGTGATCAGACGGTAGTT？GGCGCTGAATTCGCGTTGAGTATGAGCGAGCGTTGCG？3’。...

【技术特征摘要】
1.一组肝癌血清核酸适配子，其特征在于具有下列核苷酸序列(1)AP-HCS-9-10 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTATGGGCCTGGGCCGTGCAGTTAG CTCGGCGGTGTATTGTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(2)AP-HCS-9-74 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTTGACCTAAGTTAGTGGTCCTGTT GATGGTTCGTGTGGTTGAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(3)AP-HCS-9-89 :5’ - ACCGACCGTGCTGGACTCTACAGAGTGCTTGATCTCGGGTT GTCGGTGTCGGTGGACTGAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(4)AP-HCS-9-132 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTAGGAGGGTGATGCAAATGGAC GTTCAGATTAGTGTGGTCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3，(5)AP-HCS-11-3 :5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCTATGGAATGGATCGTTCTGTGTCG GGTCGTACGGGAGTGTCAGTATGAGCGAGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张焜和，陈文学，徐国峰，王婷，魏淑琴，李璇，吕农华，张吉翔，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：