本发明专利技术公开了一种制备高活性固定化酶块的制备方法。所述的制备方法首先是制备出一种泡沫状的碳块，然后将多壁碳纳米管负载在泡沫状碳块内部的孔道中，最后将胰蛋白酶固定在碳纳米管的表面上。泡沫状碳块孔道中的碳纳米管可固定大量酶分子，而泡沫状碳块孔道又为酶活性部位周围底物的扩散和产物的释放提供了通道。该酶块可在使用后取出，无需分离工序，并且在反复使用中保持着酶活性。此酶固定化方法有望在酶工程、传感器、燃料电池等领域得到应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶的固定方法。具体是将酶分子固定在碳纳米管上，再将碳纳米管固定在泡沫状碳块的孔道内，形成高酶负载量的复合酶块。
技术介绍
酶固定化是酶工程研究和应用最为重要的领域之一(Liang J. F. etal. Pharm.Sci.2000,89,979-990 ;Asanomi Y.etal. Molecules 2011,16,6041-6059;Zhang B.etal. AppI. Microbiol. Biotechnol. 2012,93,61-70)。它已经广泛地运用到化学化工、生物技术、现代医药、环境保护等行业。然而，酶蛋白是非常脆弱的，它们容易变性失活、难以回收重复使用。因此，在エ业 应用上酶通常被固定在载体上，以便进行回收并改善在各种反应环境下的化学稳定性。那些固定在载体上的酶还可以实现连续化反应。上述优势能够有效降低生成単位产物酶的成本，特别是对于那些昂贵的酶达到了节约的目的。有两类载体粒子和多孔材料。粒径小的粒子有着更大的表面积，酶的负载能力也随之提高。但是，它们更加难以分离、回收和重新利用。多孔材料易于回收，孔径越小酶负载量越高，但底物和产物在材料中的扩散同时也遇到更大的阻碍。因此，有效解决这ー问题需要设计出一种兼备高表面积和大孔径的块状载体。碳纳米管是ー种拥有大表面积的纳米级柱状材料，它已经在传感器(Shi J. etal.Nanotechnology 2011,22,355502 ；Sanchez S. et al.Analyst 2007,132,142-147 ；Joshi P. P. et al. Anal. Chem. 2005，77，3183-3188)和燃料电池(Miyake T. et al. J. Am.Chem. Soc. 2011，133 :5129-5134 ;Zebda A. et al. Nat. Commun. 2011,2,370)上得到了广泛的应用。然而，游离碳纳米管虽然可利用过滤等手段进行分离，但固定在碳纳米管上的酶的可回收性还没有被エ业应用广泛接受。本专利技术提供了ー种新型载体的制备方法，该载体是将泡沫状碳块与碳纳米管的特性结合起来用于酶的固定化，它在形态上兼备了碳纳米管的特点(如高酶负载量)和泡沫状碳块性质(如低扩散阻力)。不仅如此，这种复合酶块可直接从溶液中取出，不需要任何分离エ序。
技术实现思路
本专利技术的目的之ー是提供一种兼备高比表面和低扩散阻カ的载体。它可以与酶分子牢固結合，由此获得较高的酶催化活性和稳定性。本专利技术的目的之ニ是制备ー种具有高催化活性的固定化酶块。这种复合酶块使用简便，使用后不需要分离和再生エ序就能够重新利用。为了达到上述目的，本专利技术首先将碳纳米管固定在泡沫状碳块的孔道内，再将酶进ー步固定在碳纳米管的表面上，这样就获得了ー种兼有微米结构和纳米结构的材料。其中，泡沫状碳块的微米孔道可以减低传质阻力，使底物容易扩散到酶活性部位同时使产物易于释放。碳纳米管的表面可负载大量的酶分子，而酶块作为ー个整体又能够方便地从酶催化反应溶液中取出，重新使用。这种复合酶块需要三个步骤进行制备。具体エ艺如下在加压的条件下，将酚醛树脂溶液用乌洛托品进行交联，并逐渐释放压カ使聚合物粘流液发泡。随着聚合物浓度的増加和逐渐固化，气泡被固定在聚合物中形成气孔。继续升高温度，使聚合物熟化和硬化。聚合物在更高的温度下绝氧碳化，成为多孔的泡沫状碳块。将碳纳米管用硝酸和硫酸进行氧化，得到在外壁上带有羧基的碳纳米管。用氧化碳纳米管的分散液孵育泡沫状碳块，碳纳米管就会牢固地固定在泡沫状碳块的内部孔道 中，并形成一定的共价连接。将缓冲液中酶分子(如胰蛋白酶)进ー步对新制得的碳纳米管-泡沫状碳块载体进行孵育，酶被固定在碳纳米管外壁上，形成了酶块。所制成的酶块具有高酶负载量和低底物扩散阻力，因此赋予了较高的催化活性。以考马斯亮蓝法检验酶的负载效果，结果显示支载着碳纳米管的泡沫状碳块的负载量是泡沫状碳块的228. 3 %，是玻碳片的2838. 5 %。用N- α -苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝基苯胺的水解反应来估算固定化胰蛋白酶的催化活性。以分光光度计在410nm处监测ρ-硝基苯胺的阴离子的形成。结果表明，固定在碳纳米管-泡沫状碳块上的胰蛋白酶的活性是泡沫状碳块的252. 2%，是具有光滑表面的玻碳片的3552. 6 %。与其他固定酶一祥，固定在碳纳米管-泡沫状碳块上的胰蛋白酶的热稳定性高于相应的溶液酶。在80°C下，溶液酶几乎丧失了活性(仅残留全活性的1.5% )，而固定酶在此温度下的活性残留为71%。此外，该酶块不需要任何分离过程就可重新使用，这样就简化了化工操作的程序。由于大部分酶分子埋藏在多孔载体的内部，因此刮擦也不能使它们脱落。本专利技术的优点在于I.本专利技术所述的方法可制造出一种酶负载量大，可接近性好的载体。2.该固定化酶具有催化活性高和热稳定性好的特点。催化反应后可直接从溶液中取出重新使用，不需要分离过程。3.本专利技术所述的方法可用于生物传感器和生物燃料电池的电极。附图说明图I是碳纳米管修饰泡沫状碳块的SEM谱图。图中显示出泡沫碳块表面上的ー个孔洞的洞ロ。整个碳块表面被碳纳米管所覆盖。具体实施例方式实施例I :泡沫状碳块制备将60g酚醛树脂粉末和5g乌洛托品溶于200mL的こ醇中。溶液在高压釜中以O. 2V /min的速率加热到160°C，并在160°C和I. 6MPa的氮气压力下保温8h进行交联反应。然后在160°C下以O. 2MPa/h的速率释放高压釜中气体，使聚合物发泡。当压カ减至常压后，将样品加热到350°C，并在此温度下保持6h以熟化。在氩气保护下以5°C /min的加热速率升温到800°C进行碳化，保温3h后得到泡沫状碳块。实施例2 碳纳米管的功能化将200mg多壁碳纳米管悬浮于150mL浓硫酸和50mL浓硝酸的混Ife溶液中，在超声清洗机中振汤20min。回流3h。将悬浮液用水稀释，并用在O. 2 μ m的聚碳酸酯膜过滤，洗涤以除去酸。上述超声/过滤步骤重复3次。实施例3 碳纳米管-泡沫状碳块的制备将泡沫状碳块在真空下灌注O. 2mg碳纳米管的5mL水溶液。体系超声振荡5次，每次20min。碳块继续在碳纳米管溶液中孵育20h。结合了碳纳米管的泡沫状碳块用水反复洗涤5次，真空干燥。实施例4 胰蛋白酶在复合酶块中的固定化通过将冻干酶溶解到磷酸盐缓冲液(IOmmol/L，pH 7.0)中来制备2mg/mL胰蛋白酶的水溶液。在4°C下将碳纳米管-泡沫状碳块在5ml的胰蛋白酶溶液中孵育过夜。而后，取出固定着胰蛋白酶的碳块，用水洗涤3次，使用前在4°C下储存。利用 Bradford 方法(Kruger NJet al. ,Methods Mol. Biol. 1994, 32,9-15)测定固定前后胰蛋白酶溶液的蛋白质浓度，用蛋白质浓度的之差来计算胰蛋白酶的负载量。实施例5:催化活性检测利用N- α -苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝基苯胺作为底物来测量胰蛋白酶的活性。来自牛胰脏的胰蛋白酶催化这ー底物的水解，释放出的P-硝基苯胺在410nm处有吸收峰。通过测量反应混合物在410nm处的吸收随时间的变化来估算酶的活性。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种制备高活性块状固定化酶的工艺方法，其特征在于所述的工艺方法首先是酚醛树脂发泡和碳化为泡沫状碳块，然后将多壁碳纳米管负载在碳块内部的孔道中，最后将酶固定在碳纳米管表面上，形成碳纳米管-泡沫状碳块复合酶块。2.根据权利要求I所述的一种制备高活性块状固定化酶的工艺方法，其特征在于所固定的酶是胰蛋白酶。3.根据权利要求I所述的一种制备高活性块状固定化酶的工艺方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄积涛，邢达杰，黄薇，王缇媞，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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