多价抗体制造技术

一种多价抗体融合蛋白，其包含：重链，其在序列上从N端开始包含，名称为VH1的可变结构域、CH1区和名称为VH2的另外的可变结构域，轻链，其在序列上从N端开始包含，名称为VL1的可变结构域、CL结构域和名称为VL2的可变结构域，其中所述重链和轻链经匹配提供由VH1和VL1的第一可变结构域对形成的第一结合部位，以及由VH2和VL2的第二可变结构域对形成的第二结合部位，其中在形成结合部位的可变结构域对之间存在二硫键，并且所述融合蛋白缀合至PEG聚合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多价抗体本公开内容涉及具有两个抗原结合部位的抗体，例如其中围绕每一个部位的位阻(steric hindrance)被减小至最小，以便对祀抗原的亲和力不被所述形式不利地影响。多价抗体是已知的。然而，即使基本概念在许多年以前已被公开，但一直存在着与利用所述技术相关的实际困难，因此，其未曾被广泛用于在开发中制备药物生物制品(pharmaceutical biologic product)。非自然/非天然抗体形式可能难以表达，这可使产品成本显著增加至不能维持的水平。所述形式与标准抗体或片段相比，可能增加免疫原性或减小体内稳定性和/或可能具有不期望的药代动力学。特别地，对于非天然形式，与制备同质产物相关的问题一直是被关注的问题。例 如，如果存在超过I种的用于组合组分单体的排列，则可导致混合物。因此，可能需要精心的纯化方法，以便以令人满意的纯度水平分离期望的实体/靶实体。这已通过许多方法得到解决，例如，在双特异性双体抗体(diabody)的产生中使用短接头据认为促进适当的二聚化。然而，数据已显示，可变结构域的取向可影响该形式的表达和活性结合部位的形成。强制以期望的排列或取向装配的一个方法称为“ knob-in-hoIe ”法，其中将大的“knob”引入VH结构域(通过，例如在一些抗体中，用大的残基苯丙氨酸交换缬氨酸137以及用色氨酸替代亮氨酸45)。在一些抗体中，可以通过将苯丙氨酸98突变成甲硫氨酸以及将色氨酸87突变成丙氨酸，在例如VL结构域中引入互补的“hole”。然而，对于几种构建体，观察到减小的抗原-结合活性。在本专利技术中，轻链中的CL和重链中的ChI的提供确保了所述链的正确取向。因此，提供了重组融合蛋白，其包含重链，其在序列上从N端开始包含，可变结构域(名称SVH1)、CH1区和另外的可变结构域(名称为Vh2)，轻链，其在序列上从N端开始包含，可变结构域(名称为'I)、CL结构域和可变结构域(名称为\2~)其中所述重链和轻链经匹配提供由VhI和'I的第一可变结构域对形成的第一结合部位和由Vh2和'2的第二可变结构域对形成的第二结合部位，其中在形成结合部位的可变结构域对之间，例如在VhI与'I之间和/或在Vh2与'2之间存在二硫键，并且所述融合蛋白缀合至PEG聚合物。本文中提供的重组融合蛋白还有利地具有与完整抗体的半衰期相似的半衰期，从而可能适合用于治疗。附图概述图I显示了根据本公开内容的各种融合蛋白形式。图2A显示了各种已知的抗体片段形式。图2B显示了根据本专利技术的二聚体形式的一种可能的排列。图3显示了抗体4D5的轻链氨基酸序列。图4显示了抗体4D5的重链氨基酸序列。图5显示了 A26Fab-(3xG4S)_dsFv645，其中表面Cys突变的位置以粗体显示。图6显示了 A26Fab-(3xG4S)-dsFv645，S182和S163的PEG化突变体的非还原凝胶。本文 中使用的重链为包含ChI结构域的链。通常，所述重链不包含Fe片段，也就是说Ch2和/或Ch3片段。在一个实施方案中，重链只包含一个ChI结构域。本文中使用的VhI和乂#意指，可变区位于根据本专利技术的抗体的重链中的事实。其本身并不表示这样的可变区的来源。本文中使用的'I和\2意指，可变区位于根据本专利技术的抗体的轻链中的事实。其本身并不表示这样的可变区的来源。本文中使用的轻链包含CL结构域。在一个实施方案中，轻链只包含一个CL结构域。本文中，在轻链中作为恒定区片段的CL与在重链中作为恒定区片段的ChI的排列据认为使不适当的二聚化降至最低。在一个实施方案中，根据本公开内容的融合蛋白包含铰链，例如作为可变结构域的接头。铰链可在与全长抗体中发现的位置对应的位置上被连接至ChI的C末端并且可在ChI与乂#之间形成连接。在该实施方案中，还可在轻链中提供接头，从而'2被适当地放置以与重链中的Vh2配对。轻链中使用的接头可与重链中使用的铰链接头相同、相似或完全不同。在备选实施方案中，轻链包含例如连接至CL结构域的C末端并且将CL结构域与Vl2连接的铰链。在该实施方案中，在重链中可能需要接头来确保\2和Vh2结构域可适当地配对以形成活性部位。重链中的接头可与轻链中使用的接头相同、相似或完全不同。下文给出了适当的铰链的实例。在每一条链中提供可变结构域，以便它们形成与靶抗原适当/充分结合的预先确定的对(pre-def ined pair)。在一个实施方案中,可变结构域对对祀抗原具有IOOnm或更小,例如50nm或更小，特别地Inm或更小的亲和力。可以通过任何可能的方法，例如包括在宿主中产生抗体，随后筛选B细胞的方法来鉴定合适的可变结构域对。备选地，合适的对可通过噬菌体展示法来鉴定。曬菌体展示法是本领域已知的，且包括由Br inkman等，J. Immunol.Methods, 1995, 182,41-50 ；Ames 等，J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186 ；Kettleborough 等，Eur.J. Tmmunol. , 1994, 24, 952-958 ；Pers ic 等,Gene,1997187, 9-18 ；和 Burton 等，Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280 ；W0 90/02809 ；W0 91/10737 ；W092/01047 ；W0 92/18619 ；W0 93/11236 ；W0 95/15982 和 WO 95/20401;和 US 5,698,426 ；5，223，409 ；5, 403，484 ；5, 580，717 ；5, 427，908 ；5, 750，753 ；5, 821，047 ；5, 571，698 ；5，427，908 ；5, 516，637 ；5, 780，225 ；5, 658，727 ；5, 733，743 和 5，969，108 公开的那些噬菌体展示法。转基因小鼠或其它生物(包括其它哺乳动物)可用于产生人源化抗体。在一个实施方案中，可变结构域对(或每一个可变结构域对)为同源对(cognatepair)ο本文中使用的同源对意指，可变结构域的天然对，即，从单个抗体或表达抗体的细胞分离的可变结构域的天然对。在一个实例中，同源对是协同结合抗原的互补VH/VL对，即，它们为互补VH/VL对。通常，同源对为来源于相同抗体的VH/VL对。 在一个实例中，同源对为，作为对从‘对文库’例如Fab噬菌体展示文库分离的一对可变结构域。在一个实例中，VH/VL对是单特异性的。第一和第二结合部位是相对的项(相对于彼此)，并且为给予结合部位的名称标记，用于区分一个结合部位与另一个结合部位。如果一个结合部位被标记为“第一”，则另一结合部位被标记为“第二”。第一同源对和第二对也是相对的标记，用于在名称上区分对。在本文中，被标记为“第一对”的一个对在分子中的位置是未确定的。可变结构域可以已被优化和/或人源化。来源于同源对的已被优化/人源化的可变结构域在优化/人源化后仍被认为是同源对。本文中使用的CL是指轻链中的恒定区部分，其可以是天然存在的轻链恒定区。每一个可变结构域可直接连接至或通过接头连接至相关链中的恒定结构域。本文中使用的“直接连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.17 GB 0920127.81.一种重组融合蛋白，其包含 重链，其在序列上从N端开始包含,名称为VhI的可变结构域、ChI区和名称为Vh2的另外的可变结构域， 轻链，其在序列上从N端开始包含，名称为Vd的可变结构域、CL结构域和名称为\2的可变结构域， 其中所述重链和轻链经匹配提供由VhI和'I的第一可变结构域对形成的第一结合部位，以及由Vh2和\2的第二可变结构域对形成的第二结合部位， 其中在形成结合部位的可变结构域对之间存在二硫键，并且 所述融合蛋白缀合至PEG聚合物。2.权利要求I的重组融合蛋白，其中在VhI和'I的第一可变结构域对之间和/或Vh2和\2的第二可变结构域对之间存在二硫键。3.权利要求I或权利要求2的重组融合蛋白，其中在Vh2和\2的第二可变结构域对之间存在_■硫键。4.权利要求I至3的任一项的重组融合蛋白，其中Vh2的氨基酸通过肽键直接连接至ChI的氨基酸。5.权利要求I的重组融合蛋白，其中Vh2通过接头间接连接至ChI。6.权利要求I至5的任一项的重组融合蛋白，其中'2通过肽键直接连接至CL的氨基酸。7.权利要求I至5的任一项的重组融合蛋白，其中\2通过接头间接连接至CL。8.权利要求5或权利要求7的重组融合蛋白，其中所述接头具有SEQID NO:226中给出的序列。9.权利要求I至8的任一项的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白通过溶剂可及的半胱氨酸被PEG化。10.权利要求I至9的任一项的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白通过CHl和/或CL的链间半胱氨酸被PEG化。11.权利要求I至9的任一项的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白通过轻链中的工程改造的半胱氨酸被PEG化，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自，按照Kabat编号系统编号的位置 5、7、9、10、12、14、15、16、17、18、20、22、24、26、27、28、30、31、34、39、41、·42、43、55、56、57、60、61、63、67、68、69、70、72、74、76、77、79、81、107、108、109、110、114、·121、122、123、126、127、128、129、143、144、145、147、149、151、152、153、156、157、158、159、·160、161、167、168、169、170、171、190、195、197、199、200、202、203、205、206、210、211、212 和·213。12.权利要求I至11的任一项的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白通过轻链中的工程改造的半胱氨酸被PEG化，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自，按照Kabat编号系统编号的位置 77、107、109、143、145、149 和 210。13.权利要求I至12的任一项的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白通过重链中的工程改造的半胱氨酸被PEG化，其中所述工程改造的半胱氨酸的位置选自，按照Kabat编号系统编号的位置 3、7、8、9、10、13、15、16、17、21、26、40、43、57、5...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·P·汉弗莱斯，S·P·海伍德，A·D·G·劳森，
申请(专利权)人：UCB医药有限公司，
类型：发明
国别省市：