本发明专利技术公开了两种苯妥因的检测方法，包括以下步骤：将待测样本与抗苯妥因特异性抗体接触；根据待测样本中的物质与抗体的结合情况，判断样本中苯妥因的含量，其中抗苯妥因特异性抗体由苯妥因免疫原免疫动物得到。本发明专利技术的两种检测方法，特异性高，可以准确地测定苯妥因的含量，为苯妥因的临床药物浓度实时监测提供了依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及两种，包括苯妥因均相酶免疫测定法与苯妥因酶联免疫吸附测定法。
技术介绍
苯妥因(5,5-Diphenyl_2,4-imidazolidinedione),其结构式如式(II)所不。权利要求1.一种苯妥因(5, 5-Diphenyl_2,4-imidazolidinedione)的均相酶免疫检测方法(Homogeneous Immunoassay),使用苯妥因的均相酶免疫检验试剂,该检测试剂由苯妥因特异性抗体和苯妥因酶标偶联物组成，包括以下操作步骤 (1)采用全自动生化分析仪，将待测样本与苯妥因检测试剂分别放入样本仓和试剂仓； (2)按照下表进行检测项目参数设置；2.根据权利要求I所述的苯妥因的均相酶免疫检测方法，其特征在于所述的检测试剂制备方法包含以下步骤 (1)将抗苯妥因特异性抗体以I: 1000-1 10000的体积比稀释到均相Rl缓冲液中，均相Rl缓冲液含50mM Tris, O. 25%牛血清蛋白，50mM葡萄糖-6-磷酸和50mM烟碱腺嘌呤二核苷酸； (2)将苯妥因酶标偶联物以I: 1000-1 10000的体积比稀释到R2缓冲液中，R2缓冲液含IOOmM Tris,O. 25%牛血清蛋白； 所述的抗苯妥因特异性抗体与Rl缓冲液的体积比优选为I : 1000-1 4000 ； 所述的苯妥因酶标偶联物与R2缓冲液的体积比优选为I : 1000-1 4000。3.一种苯妥因的ELISA检测方法，使用苯妥因ELISA检验试剂，该检测试剂含有(I)抗苯妥因特异性抗体；(2)酶标偶联物及底物，包括以下操作步骤 (1)用PBS将抗苯妥因特异性抗体稀释成I 1000-1 20000的终浓度溶液，100 μ L/孔包被在96孔酶联板上，4 °C放置12-24h ； (2)用PBS洗涤3次后，加入200μ L/孔的O. 5%的BSA溶液，4°C封闭8_12h，PBS洗涤3次； (3)加入20μ L/孔的标准品； (4)加入100μ L/孔工作浓度的苯妥因酶标偶联物； (5)室温下孵育30min，PBS洗板5次； (6)每孔加入100μ L底物，优选ΤΜΒ，室温孵育30min ； (7)每孔加入100μ L终止液(2Μ硫酸)； (8)测定450nm的吸光值； 上述操作步骤(I)优选为用PBS将抗苯妥因特异性抗体稀释成I : 2000-1 10000的终浓度溶液，100L/孔包被在96孔酶联板上，4°C过夜； 所述抗苯妥因特异性抗体由苯妥因免疫原免疫动物后生产得到， 所述的苯妥因免疫原，其结构式如式(I)所示4.根据权利要求I或3所述的检测方法，其中所述的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选为多克隆抗体；所述的动物选自家兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马中的一种，优选为家兔。5.根据权利要求4所述的检测方法，其中所述的抗苯妥因特异性抗体的制备方法包含以下步骤 (1)用磷酸盐缓冲液将合成的苯妥因免疫原稀释至O.5-5. Omg/mL ； (2)经常规弗氏佐剂法对动物进行注射，注射后抽取动物特异抗血清，得到有效的抗体。6.根据权利要求5中所述的检测方法，其中所述的苯妥因免疫原的制备方法包含以下步骤 (I)苯妥因衍生物的合成 1)用50-200ml有机溶剂A溶解I.0-10. Og的羟基二苯酮和I. 0-5. Og的碳酸盐，得到溶液I ;将I. 0-10. Og的5-溴戊酸乙酯加入到溶液I中，反应完成后用5-20ml的有机溶剂A溶解反应物，经有机溶剂B萃取、干燥、浓缩得到白色固体状化合物3。2)用50-200ml有机溶剂C溶解I.0-10. Og的化学物3，加入强碱溶液反应，得到白色固体；将此白色固体经有机溶剂C萃取、无机酸溶液酸化、干燥、浓缩、纯化等步骤得到白色固体状化学物4。3)用10-50ml的有机溶剂A溶解下列化合物1.0-5.Og化学物4，0. 1-2. Og氰化钾(KCN)，I. 0-10. Og碳酸铵((NH4)2CO3)和I-IOml水。经加热反应得到的物质用强碱溶液溶解，经无机酸中和、有机溶剂B萃取、干燥、浓缩和纯化等步骤得到白色固体粉末状苯妥因衍生物。 (2)载体溶液的制备将具有免疫原性的蛋白质100-300mg溶于IO-IOOml的O.2M, pH8.5磷酸盐缓冲液中。(3)苯妥因衍生物的活化及免疫原的合成用I.0-5. Oml的有机溶剂A溶解50_500mg的苯妥因衍生物，通过1_乙基_3_(_3_ 二甲氨丙基)碳二亚胺(l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Car bodiimide, EDAC)的方法进行活化并与载体溶液进行交联反应，经透析纯化后得到具有免疫原性的苯妥因免疫原。上述方法中所述的有机溶剂A为二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMS0)、二甲基甲酰胺(N, N-Dimethylformamide, DMF)、甲醇或乙醇,优选DMF ;所述的有机溶剂B为乙酸乙酯(Ethyl acetate, EtOAc)，乙醚或氯仿，优选乙酸乙酯；所述的有机溶剂C为乙酸乙酯，乙醚，甲基叔丁基醚(methyl tertbutyl ether)或氯仿,优选甲基叔丁基醚；所述的无机酸溶液为盐酸溶液或硫酸溶液，优选盐酸溶液；所述强碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液。7.根据权利要求I和3所述的，其特征在于待测样本为生理样本。8.根据权利要求7所述的，其特征在于生理样本为血液样本或者尿液样本，优选血液样本。全文摘要本专利技术公开了两种苯妥因的检测方法，包括以下步骤将待测样本与抗苯妥因特异性抗体接触；根据待测样本中的物质与抗体的结合情况，判断样本中苯妥因的含量，其中抗苯妥因特异性抗体由苯妥因免疫原免疫动物得到。本专利技术的两种检测方法，特异性高，可以准确地测定苯妥因的含量，为苯妥因的临床药物浓度实时监测提供了依据。文档编号G01N33/531GK102636637SQ20121012553公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日专利技术者孟雷, 田军, 蔡江丽, 虞留明, 袁红霞 申请人:嘉兴九七九生物技术有限公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：虞留明，田军，袁红霞，孟雷，蔡江丽，
申请(专利权)人：嘉兴九七九生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。