本发明专利技术涉及一种鉴别诊断新城疫强弱毒株的胶体金快速诊断试纸条，其特征在于：试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的新城疫强毒株串联F蛋白裂解位点8Fp重组蛋白；硝酸纤维素膜上分别包被有SPA构成的检测线T线和串联F蛋白裂解位点8Fp重组蛋白单克隆抗体1D8构成的质控线C线。其具有特异性强、灵敏度高、操作简单和诊断快速的显著优点，可用于新城疫强弱毒株的快速鉴别诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新城疫强弱毒株的胶体金快速诊断试纸条，属于一种新的动物诊断试剂，主要用来鉴别诊断强毒株感染的家禽；应用于畜牧兽医学领域。
技术介绍
新城疫(Newcastle disease ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus NDV)引起的禽类一种急性高度接触性传染疾病，是影响养禽业最重要的病毒性传染病之一，其分布十分广泛，许多发达国家也时有发生。其发病率和死亡率较高，本病被国际兽疫局列为必报疫病名录之一。新城疫对我国养禽业的危害仍然很大，尽管我国目前已经普遍采取了以免疫预防为主的综合预防措施，但新城疫还没有从根本上得到控制。免疫鸡群仍然时有新城疫的发生，原因是多方面的，但与NDV的变异、强弱毒株的混合感染可能有很大关系，特别是近年来我国一方面非典型新城疫逐年增多，在外界环境因素的影响下不断的发生变异，给新城疫的诊断和预防带来了难度。研究表明，新城疫病毒基因组编码两种囊膜糖蛋白，即血凝素-神经氨酸酶蛋白 (HN蛋白)和融合蛋白(F蛋白);四种结构蛋白，即基质蛋白(M蛋白)、核衣壳蛋白(NP蛋白)、 磷蛋白(P蛋白)和大蛋白(L蛋白)，此外还编码两种非结构蛋白。F基因的序列已经被测定，其大小为1792bp，编码553个氨基酸。F蛋白前体H)经裂解产生Fl和F2两个片段后， 才使病毒具有感染性。新城疫病毒根据毒力的不同分为三种类型，即速发型、中发型和缓发型，对不同毒株F基因的序列分析表明，毒力不同的毒株F基因裂解位点区氨基酸的组成不同。因此，F基因裂解位点区的氨基酸组成是新城疫病毒致病力的分子基础。目前新城疫病毒强弱毒株的鉴定方法有MDT(最小致死量致死鸡胚平均死亡时间)、ICPI (I日龄雏鸡脑内接种致病指数)、IVPI (6周龄鸡静脉接种致病指数)、RT-PCR技术、蚀斑形成和ELISA。但是，MDT、ICPI、IVPI以及蚀斑形成鉴定NDV株的强弱试验检测效率低，耗时长，不适于大量样品的快速检测。RT-PCR方法是新兴的一种快速诊断方法，但是其受操作人员技术水平和现场条件的约束较多，不利于在现场进行大规模样品的检测。而 ELISA诊断方法虽然简便易学，但操作时间长并需要专门的检测设备。因此研制特异性强、 灵敏度高、检测准确的免疫胶体金快速诊断试纸条是新城疫检疫的当务之急。免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新城疫强弱毒株的胶体金快速诊断试纸条，其利用免疫学抗原抗体能特异性结合原理，胶体金标记新城疫强毒株F蛋白串联多肽后与样品中特异性抗体结合，这种抗原抗体结合物再与SPA结合，形成抗原-抗体-SPA结合物在硝酸纤维素膜(NC膜)上出现颜色反应，可以肉眼观察；具有简单、快速、敏感和特异性好等特点。 并且价格低廉，适用于基层或临床鉴别诊断新城疫强弱毒株。本专利技术的技术方案是这样实现的一种鉴别新城疫强弱毒株的胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的抗新城疫强毒株串联F蛋白裂解位点重组蛋白；硝酸纤维素膜上分别包被有SPA构成的检测线T线和抗新城疫强毒株F蛋白串联多肽单克隆抗体构成的质控线C线。所述的结合垫上包被的胶体金标记的抗新城疫强毒株F蛋白串联多肽单克隆抗体1D8的制备方法如下(I)新城疫病毒强毒株F蛋白裂解位点的串联及人工合成，将编码国内外目前普遍流行的新城疫强毒株F蛋白裂解位点区GRRQRRF、GRRQKRF多肽的氨基酸序列和编码国内外目前新发现的新城疫强毒株F蛋白裂解位点区RRRQKRF、GRRKKRF多肽的氨基酸序列以编码柔性氨基酸(_甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸_，即-G-G-G-G-S-)的氨基酸序列相互联结，人工合成Fp (F protein multitude peptide)四拷贝体4Fp和八拷贝体8Fp碱基。(2)通过连接、转化、酶切鉴定、原核表达制备碱基翻译成蛋白即抗新城疫强毒株串联F蛋白裂解位点重组蛋白。(3)标记胶体金，制备金标抗原，用O. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2，按IOOug 抗体/毫升胶体金加入抗新城疫强毒株串联多肽8Fp，磁力搅拌器混匀30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置I小时。4°C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4°C备用。(4)将结合垫浸泡于封闭液即2% BSA、0. 5%吐温-20、2. 5%蔗糖、O. 05%叠氮钠、O.OlM PBS中30分钟，37°C烘干；然后将制备好的金标抗原均匀喷涂于结合垫上，每毫升铺 20平方厘米，冻干、保存。(5)然后制备抗新城疫强毒株串联F蛋白裂解位点重组蛋白单克隆抗体，利用免疫Balb/c小鼠、杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗4Fp、8Fp杂交瘤细胞株 2E9、1D8，经ELISA方法检测，显示1D8效价高于2E9，因此选用多肽单克隆抗体1D8构成的质控线作为C线。所述的硝酸纤维素膜上的检测线T线是选用包被缓冲液稀释的SPA喷涂于检测线上，用包被缓冲液将SPA稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为检测线T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫端约5mm。所述的抗新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联多肽单克隆抗体构成的质控线C线是选用包被缓冲液稀释的抗新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联多肽单克隆抗体喷涂于检测线上，用包被缓冲液将抗新城疫强毒株串联F蛋白裂解位点重组蛋白单克隆抗体稀释到 50-100ug/ml，调整机器划线为质控线C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm ;两线距离5-8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上，可与金标抗体结合，以此检验试纸条的有效性。所述该纸条的检测方法是样品中新城疫病毒强毒株特异性F蛋白裂解位点特异性抗体先和胶体金标记的新城疫强毒株串联F蛋白裂解位点重组蛋白结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中存在新城疫病毒强毒株F蛋白裂解位点特异性抗体，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素膜上的SPA，就会形成金标抗原-新城疫强毒株F裂解位点特异性抗体-SPA抗复合物，从而凝集在检测线上，形成特异性的红色沉淀线； 没有和新城疫强毒株F蛋白裂解位点特异性抗体结合的金标抗原则会直接通过检测线，富集在质控线上形成红色沉淀线，即判为阳性结果。若样品中无新城疫强毒，反应复合物到达检测线时本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁壮，吕字华，张晓东，母连志，姜翠翠，韩明明，黄志强，李想，朱利塞，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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