本发明专利技术提供了一种高活性的酞菁锌-单克隆抗体肿瘤靶向光敏免疫偶联物的制备方法及其抗肿瘤应用的技术方法。利用结构单一的单羧基酞菁锌与五聚赖氨酸酰肼反应，形成水溶性的高反应活性的单羧基酞菁锌酰肼衍生物，同时选择具有抗肿瘤活性的单克隆抗体，在中性条件下，用高碘酸钠温和的氧化与抗体活性无关的糖基为醛基，4℃，过量的单羧基酞菁锌酰肼衍生物极易与之反应，并进一步还原成稳定的光敏免疫偶联物，得到高纯度的光敏免疫偶联物。本法制备的特点是低温、中性条件、不用任何有机溶剂。并通过体外抗肿瘤实验证实该偶联物具有很好的选择性和抗肿瘤活性，具有应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药、生物技术、化学、免疫生物学领域。
技术介绍
近年来，国内外文献越来越多地报道了一种新的肿瘤治疗方法——光动力疗法 (PDT)。肿瘤光动力疗法是现代肿瘤微创或无创治疗领域的最新进展，于1996年被美国FDA 批准应用于临床，并在美国、日本、英国、法国、德国、加拿大等国用于多种肿瘤治疗取得成功。2003年5月中国SFDA批准了这一治疗系统进入临床应用。光动力疗法是一种正在发展中的治疗恶性肿瘤的新型治疗手段，临床上已用于多种肿瘤的治疗。为了增加光动力疗效，我们选用能与肿瘤细胞特异性结合的单克隆抗体为载药工具，将光敏剂与抗体共价偶联，形成稳定的光敏免疫偶联物，由抗体进行导向，使光敏剂与特定肿瘤细胞进行特异性结合，达到靶向给药的目的，提高治疗的依从性。光动力治疗是一种很有前景的肿瘤治疗方法，在临床上已经被运用于头颈部肿瘤、食管癌、乳腺癌、基底细胞癌等多种肿瘤的治疗，但是目前的光动力治疗的药物仍存在一些不足，如光敏剂对肿瘤的选择性差；存在光毒性反应，治疗后病人避光时间长。为了克服这些不足，人们开始进行了光免疫治疗的研究，达到靶向给药的目的。光免疫治疗是指将光敏剂与单克隆抗体通过化学方法联接，制备出光敏免疫偶联物，旨在选择性的将光敏剂运输到肿瘤部位，使肿瘤部位的光敏剂浓度增高，减少用量， 提高疗效，同时，由于皮肤对大分子物质渗透性差，也可以降低光毒性反应，缩短避光时间。 1983年加拿大的Mew. D等首先报道了血卟啉与单克隆抗体的交联物对靶细胞具有杀伤作用。在国内，制备血卟啉一抗体偶联物已有先例，刘建源等将血卟啉衍生物与抗CEA单抗制成免疫偶联物，肿瘤细胞特异结合的单抗与光敏剂偶联，使得光敏剂通过单抗的导向作用到达肿瘤组织的剂量增加、滞留时间延长且吸收增加，并且副作用减少。酞菁及其衍生物以其良好的光热稳定性、强的红外吸收、和较强的光动力效应等优点，成为新一代光敏剂中的佼佼者。本项专利技术主要利用一种单取代酞菁锌与靶向肿瘤的单克隆抗体制备光敏免疫偶联物，提高光动力治疗的靶向特异性，以增加该光敏剂的选择性，同时也减少它对正常细胞的毒性。
技术实现思路
本申请提供了一种高活性的酞菁锌-单克隆抗体肿瘤靶向光敏免疫偶联物的制备方法及其抗肿瘤应用的技术方法(图I)，所制备的光敏免疫偶联物具有成本低、稳定性好、抗肿瘤活性高等特点。一、本项专利技术所用的单克隆抗体是具有如下特征的单克隆抗体I)分子量150-170KDa ；2)吸光特性280nm具有特征吸收峰；3)生物学特性单克隆抗体，能特异性识别肿瘤细胞表面生长因子受体，并与之发生抗原-抗体反应。4)本项专利技术所述的单克隆抗体包括曲妥珠单抗(Herceptin)、西妥昔单抗(cetuximab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)等能特异性识别肿瘤细胞表面生长因子受体的单克隆抗体。二、酞菁锌-单克隆抗体肿瘤靶向光敏免疫偶联物的制备方法如下I)水溶性单羧基酞菁锌酰肼衍生物的制备，以已公开的“一种广谱、低毒性的酞菁类杀菌剂及其制备方法和用途”(专利申请号200510107773)所提及的一种新型酞菁类光敏剂，即单羧基取代酞菁锌(ZnPc-COOH)为基础，将单羧基取代酞菁锌与表面带有五聚赖氨酸(5K)的树脂反应，再用水合肼肼解，脱去保护基，形成水溶性单羧基酞菁锌酰肼衍生物(ZnPC-C0-5K-NHNH2)。本项专利技术利用水溶性单羧基酞菁锌酰肼衍生物与单克隆抗体共价偶联，目前在国内外均未见有此化合物的相关报道。2)抗体氧化单克隆抗体在PH7. 2的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度IOmM的高碘酸钠，25°C氧化30min后，加入终浓度IOmM的抗坏血酸，将残留的高碘酸钠彻底还原成碘离子，防止残留的高碘酸钠氧化将要偶联的酞菁锌，本专利技术利用抗坏血酸还原高碘酸钠，这种做法目前在国内外均未见有此化合物的相关报道。3)将氧化后的单克隆抗体与ZnPC-C0-5K-NHNH2偶联，取氧化后的单克隆抗体与单羧基酞菁锌酰肼衍生物按摩尔比I : 10，溶于在PH7. 2的磷酸盐缓冲液中，混匀，4°C冰箱避光涡旋震荡过夜后，加入还原剂，4°C冰箱，反应4h，形成稳定偶联物。本专利技术在中性的水溶液中完成抗体与酞菁锌的偶联，最大程度的保存抗体的活性，这种做法目前在国内外均未见有此化合物的相关报道。4)用Sephadex GlOO凝胶柱分离光敏免疫偶联物，以磷酸盐缓冲液(PBS)为洗脱液，收集第一洗脱峰，用超滤离心管浓缩备用。本专利技术是在中性的水溶液中完成抗体与酞菁锌的偶联，由于单羧基酞菁锌酰肼衍生物是溶于水的，因此可以用PBS作为洗脱液，除去游离的单羧基酞菁锌酰肼衍生物，不用有机溶剂，最大程度的保存抗体的活性，这种做法目前在国内外均未见有此化合物的相关报道。三、酞菁锌-单克隆抗体肿瘤靶向光敏免疫偶联物的鉴定方法用非还原SDS-page电泳检测纯度。偶联比计算偶联物溶于PBS (含O. 1% tween80)中，UV-Vis分光光度计扫全谱， 得其Q带最大吸收波长λ max ο分别检测偶联物的Amax、A280nm,依据下列公式计算偶联度(DOL) :Aprotein = A280nm_AmaxXCF,其中，CF = ε 280nm, free dye/ ε max, free dye, Cprotein = Aprotein/ ε protein, DOL = Amax/Cprotein/ ε max, free dye,粗略估计抗体的摩尔消光系数ε 280nm = 203，OOOM-lcm-l，将偶联物在PBS溶液(含0. 1% tween80)中的A280nm、A674nm，代入公式，可得偶联比，偶联比在2-7之间较好。3)用酶联免疫分析(ELISA)技术，测定光敏免疫偶联物与特定抗原的效价，效价越高越好。四、本专利技术还提供了光敏免疫偶联物抗肿瘤的测定方法将制备好的光敏免疫偶联物，用0.22μπι的无菌滤器过滤除菌，并稀释成不同的浓度备用。选择含有特定的表面生长因子肿瘤细胞，该生长因子能特异性的被光敏免疫偶联物识别。将肿瘤细胞接种于无菌96孔板上，每孔1-2万个细胞，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的光敏免疫偶联物，37°C孵育24h后吸出，加入PBS洗涤3次后，加入新鲜培养基，用波长670nm，能量密度l_100J/Cm2的激光照射后， 37°C 孵育 24h。alamarBlue (一种氧化还原指示剂，能根据细胞的代谢活性产生吸光度变化和荧光信号)法测定细胞存活率。附图说明图I单克隆抗体与ZnPC-C0-5K_NHNH2偶联示意图；图2ZnPC-C0-5K_NHNH2 制备路线图；图3聚丙烯酰胺凝胶未经考马斯亮蓝染色，其中蛋白无色，含有酞菁锌分子的电泳条带均为绿色，l、ZnPC-C0-5K-NHNH2 ;2、未偶联的尼妥珠单抗；3、未经纯化的酞菁锌-尼妥珠单抗光敏免疫偶联物；4、经纯化的酞菁锌-尼妥珠单抗光敏免疫偶联物；图4聚丙烯酰胺凝胶经考马斯亮蓝染色，其中蛋白和含有酞菁锌分子的电泳条带均为蓝色，l、ZnPC-C0-5K-NHNH2 ;2、未经偶联的尼妥珠单抗；3、未经纯化的酞菁锌-尼妥珠单抗光敏免疫偶联物；4、经纯化的酞菁锌-尼妥珠单抗光敏免疫偶联物。图5光免疫偶联物暗毒性；图6光免疫偶联本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄明东，周山勇，陈卓，陈锦灿，胡萍，
申请(专利权)人：中国科学院福建物质结构研究所，
类型：发明
国别省市：
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