本发明专利技术提供一种制备金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖和运载体分子的偶联物的方法，其包括以下步骤：(a)使荚膜多糖解聚得到多糖片段；(b)氧化该片段以便将醛基引入所述片段中的至少一个糖残基上得到氧化糖残基；和(c)通过醛基将该氧化糖残基偶联于运载体分子，从而得到该偶联物。步骤(c)中的偶联可以是直接偶联，或者可以是通过接头分子进行偶联。本发明专利技术还提供由该方法获得或可获得的偶联物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于将细菌荚膜糖，具体是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureuS)5型或8型荚膜多糖偶联至运载体以形成糖偶联物的领域。所述糖偶联物可用于免疫。
技术介绍
在抵御有荚膜细菌的疫苗中使用细菌的荚膜糖已有多年历史。然而，由于糖是不依赖于T细胞的抗原，它们的免疫原性很弱。与载体偶联可将T-非依赖性抗原转化成T-依赖性抗原，从而增强记忆应答，并产生保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶联物，原型偶联疫苗针对流感嗜血菌(Haemohilus influenzae) ( ‘Hib，)。已经记载其偶联疫苗的另一种细菌是金黄色葡萄球菌(S. aureus)。已经从金黄色葡萄球菌中分离到各种多糖用于糖偶联物。两种特别感兴趣的多糖是5型和8型荚膜多糖。大约60%的人金黄色葡萄球菌菌株是8型，大约30%是5型。有关5型和8型偶联物的大量工作是由i^attom等进行的，可参见文献如参考文献1-9。用于偶联5型和8型多糖的!^attom法通常包括用胱胺使纯化多糖巯基化。该反应依赖荚膜多糖中存在羧基基团。 这些基团在碳二亚胺如EDAC存在下与胱胺发生反应。然后，将衍生多糖偶联于运载体蛋白如绿脓假单胞菌(Pseudomononas aeruginosa)内毒素A (ETA)，通常通过接头偶联。 其它研究者已通过还原胺化；戊二醛偶联；或多糖上的羟基与氰基化剂如 CDAP 或三聚氰酰氯(cyanuric trichloride)的反应偶联纯化的5型和8型荚膜多糖。虽然已证明i^attom法制备的偶联疫苗在人体中安全且有免疫原性，但仍然需要其它更好的方式来制备金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖的偶联物。
技术实现思路
本专利技术基于可用于代替现有技术公开的偶联方法的偶联方法。与这些方法不同， 本专利技术方法不包括通过多糖中的羟基或羧酸基团进行偶联。因此，与现有技术相比该方法使这些基团的形式更接近天然多糖中的形式。替代使用这些基团的是，该方法包括在多糖中产生反应性醛基用于偶联。与现有技术的偶联物相比，所得的偶联物可具有不同、优选改进的免疫学特性。因此，本专利技术提供将金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖偶联于运载体蛋白的另选或改进的方法和从其获得的偶联物。本专利技术还提供可用于本专利技术方法的中间体以及制备这些中间体的方法。第一方面，本专利技术提供一种制备金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖和运载体分子的偶联物的方法，其包括以下步骤(a)使荚膜多糖解聚得到多糖片段；(b)氧化该片段以便将醛基引入所述片段中的至少一个糖残基上得到氧化糖残基；和(c)通过所述醛基将该氧化糖残基偶联于运载体分子，从而得到该偶联物。步骤(c)中的偶联可以是直接偶联，或者可以是通过接头分子进行偶联。本专利技术还提供由该方法获得或可获得的偶联物。荚膜多糖本专利技术基于金黄色葡萄球菌5型和8型的荚膜多糖。5型和8型荚膜多糖的结构参见参考文献14和15，例如5 型— 4) - β -D-ManNAcA (30Ac) - (1 — 4) - α -L-FucNAc (1 — 3) - β -D-FucNAc-(1 —8 型— 3)-β -D-ManNAcA(40Ac)-(1 ^ 3) - α -L-FucNAc (1 — 3) - β -D-FucNAc-(1 —近期的NMR谱图数据导致将这些结构修改为5 型— 4)- β -D-ManNAcA-(1 — 4)_ α -L-FucNAc(30Ac)_(1 — 3)_ β -D-FucNAc-(1 —8 型— 3) - β -D-ManNAcA (40Ac) - (1 — 3) - α -L-FucNAc (1 — 3) - α -D-FucNAc (1 —可以相对于天然情况下发现的荚膜多糖对该多糖进行化学修饰。例如，多糖可被去-0-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、 N-丙酰化(部分或全部)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但通常在偶联前进行。根据具体多糖，去乙酰化可能影响或不影响其免疫原性，如NeisVac-C 疫苗采用去-0-乙酰化的多糖，而Menjugate 是乙酰化的，但这两种疫苗都有效。可通过常规试验评价去乙酰化等的效果。例如，金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖上0乙酰化的相关性可参见参考文献6。据该文献称，天然多糖具有75%0_乙酰化。这些多糖将抗体诱导至多糖主链和0-乙酰基上。具有0%0_乙酰化的多糖仍然引发针对该多糖主链的抗体。两种抗体类型对0-乙酰基含量不同的金黄色葡萄球菌菌株有调理活性。因此，本专利技术所用的 5型或8型荚膜多糖可具有0至100%0_乙酰化。例如，5型荚膜多糖的0-乙酰化程度可以是 10-100%、10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、 90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。或者，可采用0%0乙酰化的5型荚膜多糖。相似地,8型荚膜多糖的0乙酰化程度可以是10-100%、10-100%、20-100%、30-100%、40100%、 50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90% 或 80-90%。或者， 可采用0%0乙酰化的8型荚膜多糖。在一个实施方式中，5型和8型荚膜多糖的0-乙酰化程度可以是 10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、 90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在其它实施方式中，使用0%0_乙酰化的5型和8型荚膜多糖。本专利技术所用5型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100%、50-100%、 75-100%,80-100%,90-100%或95_100%。通常5型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100%。相似地，本专利技术所用8型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100%、50-100%、75-100%、80-100%、 90-100%或95-100%。通常8型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100%。在一个实施方式中，5 型和8型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100%,50-100%,75-100%,80-100%,90-100%或 95-100%。通常5型和8型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100%。多糖的0-乙酰化程度可通过本领域已知的任何方法测定，例如质子NMR(如参考文献17、18、19或20所述)。参考文献21中记载了另一种方法。可采用类似方法测定多糖的N-乙酰化程度。可通过水解去除0-乙酰基，例如用碱如无水胼处理。5可使用类似方法去除N-乙酰基。为了维持5型和/或8荚膜多糖上的高水平0-乙酰化， 最大程度减少导致0-乙酰基水解的处理，例如在极端pH下的处理。可通过已知技术纯化荚膜多糖，如本文引用的参考文献所述。典型方法包括用苯酚-乙醇灭活金黄色葡萄球菌细胞、离心、溶葡萄球菌素处理、RNA酶/DNA酶处理、离心、渗析、蛋白酶处理、进一步渗析、过滤、用乙醇/CaCl2沉淀、渗析、冻干、阴离子交换色谱、渗析、 冻干、大小排阻色谱、渗析和冻干。另一方法包括高本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：F·伯尔蒂，P·科斯塔蒂诺，M·R·罗马诺，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。