本发明专利技术涉及一个来源于海洋微藻等鞭金藻(Isochrysis?sphaerica)的Δ4-脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法。本发明专利技术以一种等鞭金藻(Isochrysis?sphaerica)为材料，通过设计简并引物扩增基因核心序列，再采用基因组步移的方法扩增出全长Δ4-脂肪酸去饱和酶基因isfad4。通过在毕赤酵母中异源表达isfad4证实了IsFAD4的Δ4-脂肪酸去饱和酶功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一个来源于海洋微藻等鞭金藻(Isochrysis sphaerica)的Δ4-脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法。
技术介绍
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturasedfatty acids，PUFAs)，如二十碳五烯酸 (Eicosatetraenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)等是人体中枢神经系统膜脂结构的主要成分，对人体特别是婴幼儿大脑和神经系统的发育是必不可少的，在医学和营养保健方面具有重要的作用。人体合成EPA和DHA的效率极低，在日常生活中补充足够的EPA和DHA对维持身体健康极为重要。目前市场上该类脂肪酸主要来源于深海鱼油，环境污染问题及鱼类资源的有限性使得人们必需寻找持久的、稳定安全的EPA 和DHA替代来源。已知某些微生物如真菌和海洋微藻能从头合成PUFAs且体内含量丰富， 目前直接从这些微生物发酵培养制备商业化的PUFAs只是在极少数物种中取得成功，高提取成本和低产量是需要克服的主要瓶颈。另一方面，基因工程已经能实现在一些植物中合成PUFAs，利用转基因植物尤其是油料作物作为“绿色细胞工厂”生产PUFAs也是今后发展的一个重要方向。一些微生物拥有合成PUFAs的全套基因，是转基因研究中优良基因的主要来源，因此从这些微生物中克隆合成PUFAs所必需的去饱和酶基因和延长酶基因是转基因研究及开发的基础。图1显示了生物体内合成PUFAs的主要过程，Δ 4_脂肪酸去饱和酶处于整个途径的最下游，是将二十二碳五烯酸(Docosapentaenoic acid, DPA)转化生成DHA所必需的一个脂肪酸去饱和酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种等鞭金藻(Isochrysis sphaerica) Δ 4_脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法，该基因具有△ 4-脂肪酸去饱和酶功能。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是等鞭金藻(Isochrysis sphaerica) Δ 4脂肪酸去饱和酶基因，其特征在于它的基因的全长序列如下atgtgcaacgcggcagtcgagaagaagcagccacccaggccttcgtggacgaagatccac60ggccgcgtcgttgacgtcgccaacttccgccacccaggcggcaacatcctagacctcttt120ctggggatggacgccaccagtgcatttgagcagttccatggccaccacaagggcgcatgg180aagatgctccactcgttgcccgagaaagttgtcgatcaggccgatattcccacccagaac240gacgagcacgtcgccgaaatgacccgtctgatgacctcgtggcgcgagcgtggcctcttc300aagcctcgcccagtcgcctcggctgtctatggcatctgcgttgtgcttgcgatcatcgcg360tcggtcgcgtgcgcaccgtacgctcctgtgatcgctggtatcgcggtgggcacttgctgg420gcgcagtgcggcttcctgcagcacatgggaggccaccgagagtgggggcgcaagtggtcg480tttgctttccagcacttttttgagggcctcctgaagggagggtcggcctcgtggtggcga540aaccggcacaacaagcaccacgctaagacaaacgtgattggggaggacggcgaccttcqc600accacgcctttttttgcgtgggaccctactcttgccaagaaggtgcctgactggtcgctc660cgaacgcaagccttcaccttccttccggccCttggtgCgtacgtcttcattttcgctttc720acggtgcgcaagtactccgttgtcaagcgcctctggcatgaggtcgcccttatgctcgcc780cactacgcgatcttcgcctggggcctccacgtcgccggtgcgacgctgaaggcaggcctc840acattctattgcacgggctatgcatggcagggcatctaccttggcttcttcttcggtctc900tcgcactttgctgttgagcgcgtgccatcgacggccacgtggctcgagtccacgatgatt960ggcaccatcgactggagcggctcctccgccttctgcggctacctttctggcttcctcaac1020atccagatcgagcaccacatggcgccacaaatgcccatggagaacctccgacaaatccgg1080gctgactgcaaggcttccgccgagaagtttggcctcccgtaccgtgagatgtccttcctc1140gctgccgtcaagctcatgatcaacgggctctaccagaccggcaaggaggagctgaagttg1200cgatcagatcggcgcaaatactcgcgtgcacaggcctaccttggtgcggcgagcgctgtg1260gttgagacgctcaaggcgga.ttga1284ο上述等鞭金藻(Isochrysis sphaerica) Δ 4_脂肪酸去饱和酶基因isfad4的克隆方法，其特征在于对已报道的Δ4-脂肪酸去饱和酶氨基酸序列进行比对，根据比对结果在保守区LQHMGGH和QIEHHMAP设计简并引物IsFl和IsRl ；以提取的等鞭金藻(Isochrysis sphaerica)总基因组DNA为模板，以IsFl/IsRl为引物，采用Touch-Down PCR方法扩增出保守区间对应的基因片段，克隆到PMD18-T载体并测序；通过构建等鞭金藻(Isochrysis sphaerica)基因组步移文库，采用接头PCR(Adaptor-PCR)和热不对称交错PCR(TAIL-PCR) 扩增出等鞭金藻(Isochrysis sphaerica) isfad4基因片段5，和3，端的侧翼序列；将获得的侧翼序列与之前得到的基因片段进行拼接，即得到等鞭金藻(Isochrysis sphaerica) isfad4结构基因的全长序列(即等鞭金藻(Isochrysis sphaerica) Δ4-脂肪酸去饱和酶基因的全长序列)。与现有的脂肪酸去饱和酶基因相比，该基因具有以下特点1)球等鞭金藻(Isochrysis sphaerica)中富含DHA，具有很大的应用潜力。本专利技术从一种等鞭金藻(Isochrysis sphaerica)中克隆到Δ 4_脂肪酸去饱和酶基因isfad4， 该基因具有Δ4-脂肪酸去饱和酶功能。在毕赤酵母中异源表达Δ4-脂肪酸去饱和酶 IsFAD4,通过在发酵培养基中添加底物DPA测定IsFAD4活性，证实IsFAD4将DPA转化为 DHA的效率可接近80 %。等边金藻属是目前已报道的DHA含量最高的一种海洋微藻，因此， 从该属中克隆得到的Δ4-脂肪酸去饱和酶基因isfad4是转基因研究及本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江木兰，万霞，龚阳敏，梁焯，张银波，郭兵，张燕，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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