球等鞭金藻Δ９延长酶的核苷酸序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种从产ＤＨＡ的球等鞭金藻中分离的编码Δ９延长酶的核苷酸序列及其应用。它是具有ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１所示的核苷酸序列或编码具有ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：２所示的氨基酸序列的核苷酸序列及其多肽。本发明专利技术包括编码Δ９延长酶的核苷酸序列与表达载体连接而成的进行功能性表达的重组表达载体以及含有本发明专利技术重组表达载体的酵母细胞、霉菌细胞及其后代细胞。用上述的核苷酸序列直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ９延长酶或直接利用多肽序列产生多不饱和脂肪酸的方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
球等鞭金藻as延长酶的核苷酸序列及其应用
:本专利技术属于生物和遗传工程
，涉及从一种产DHA的球等鞭金 藻(Isochrysis galbana)中克隆A9延长酶基因，具体讲是球等鞭金藻八9延长酶的核苷 酸序列及其应用。将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中， 利用其编码A9延长酶产生多不饱和脂肪酸的方法和应用。
技术介绍
:多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFAs)是指含有两 个或两个以上顺式双键、碳原子数为16至22的直链脂肪酸。多不饱和脂肪酸是以多种形 式存在于细胞中如细胞膜、储存脂、甘油三酯磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作为生物膜结构中磷 脂的重要成分之一，PUFAs的种类、数量、饱和度的改变会直接影响生物膜的刚性结构，因此 影响了与刚性结构相关的各种生理功能。经过研究发现PUFAs与包括心血管疾病，糖尿病、 关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎在内的多种慢性疾病相关，并且可以通过影响细胞的增殖和 信号传导途径来影响癌症的发生和发展情况。最近的研究表明，PUFAs还能影响骨骼的生 长与修复过程。不仅如此PUFAs还能作为一种重要的生理活性物质影响胎儿的发育。因此 PUFAs的生物合成以及合成途径中的一些关键酶受到广泛的关注。 PUFAs的合成主要是由碳链的延长和脱氢两个主要反应组成，合成的最初底物是 饱和脂肪酸软脂酸和硬脂酸。为了适应不同的自然界环境，不同的物种在基本的合成途 径基础之上又衍生出了各种不同PUFAa合成机制。除了传统的n-6和n_3两类不同的多 不饱和脂肪酸途径外，在藻类等微生物中又发现了第三种分支合成途径，即A9延长酶途 径亚油酸(LinoleicAcid， LA， C18:2n-6， A 9， 12)或a亚麻酸(a-LinolenicAcid， ALA， C18:3n-3， ) A 9， 12， 15) A 9延长酶的催化下生成二十碳二烯酸EDA (Eicosadienoic Acid， EDA， C20:2n-6， A 11， 14)和二十碳三烯酸Etr (EicosatrienoicAcid， EtrA， C20:3n-3， All，14，17)，然后通过A8脱氢酶生成二高y亚麻酸DGLA(Dihomo-y-LinolenicAcid， DGLA，C20:3n-6， A8，11，14)和二十碳四烯酸ETA(EicosatetraenoicAcid， C20:4n-3， A8， 11， 14， 17)，再进入n-6和n-3合成途径，经一系列的碳链延长和脱氢反应合成花生四烯 酸(Arachidonic acid， AA. C20:4n_6， A 5， 8， 11， 14) 、 二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid， EPA. C20:5n-3， A 5， 8， 11， 14， 17)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid， DHA. C22:6n-3， A 4， 5， 8， 11， 14， 17)等有生物活性的长链多不饱和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids， LC-PUFAs)。包括a _亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸在保 健和医疗方面有很广阔的应用前景。研究不饱和脂肪酸的合成和它的生理作用成为当前的 热点之一。A 9延长酶的克隆对于PUFAs的合成和应用研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的一是提供从球等鞭金藻中分离的编码八9延长酶的核 苷酸序列或其核苷酸序列的片段、类似物或衍生物。从一种球等鞭金藻中克隆八9延长酶 基因，具体讲是球等鞭金藻A9延长酶的核苷酸序列及其应用。 本专利技术的目的之二是提供由该核苷酸序列所编码的A9延长酶多肽、或其片段、类 似物或衍生物。 本专利技术的目的之三是提供含有该基因核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能 性表达的重组表达载体。 本专利技术的目的之四是提供含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调 节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代。 本专利技术的目的之五是提供一种用含有该基因核苷酸序列、或该基因核苷酸序列与 异源调节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞、或该核苷酸序列 所编码的A9延长酶多肽制备多不饱和脂肪酸的方法。 本专利技术第一方面是，提供了 SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或核苷酸序列的片段、 类似物和衍生物。 本专利技术分离的八9延长酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序 列，与选自下组的一种核苷酸序列有至少65%的同源性1)编码SEQ ID N0:2氨基酸序列 的活性多肽的核苷酸序列；(2)与核苷酸序列(1)互补的核苷酸序列。准确地，该核苷酸序 列是选自下组中的一种(a)具有SEQ ID NO :1序列中1-1653的序列和(b)具有SEQ ID NO :1中45-830的序列。 本专利技术的第二方面是，提供分离的上述核苷酸序列所编码的多肽，该多肽包含具 有SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的多肽、或其片段、或其保守性变异多肽、或其衍生类似 物。更准确地，该多肽是具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸变异不超 过30%的衍生物。本专利技术的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本 专利技术的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核 宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物)细胞中产生。 本专利技术的第三方面是，提供了含有上述核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表 达载体；所述的重组表达载体具体是PYES2. O-ASE或pX952A。 本专利技术的第四方面是，提供了一种用含有该基因核苷酸序列、或者该基因核苷酸 序列与异源调节序列连接的质粒或病毒重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细 胞、或用该核苷酸序列所编码的A9延长酶多肽制备不饱和脂肪酸的方法。这些宿主细胞 包括细菌、真菌、酵母、霉菌、高等植物、昆虫或哺乳动物等细胞。 本专利技术的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 本专利技术所涉及的技术术语的含义分离的是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是 天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的核苷酸序列和多肽是没有分离纯化的，但同 样的核苷酸序列或多肽如从天然状态中与同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。 分离的核苷酸序列是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其 它物质。本领域的技术人员能用标准的DNA纯化技术纯化的。球等鞭金藻A9延长酶的核苷酸序列是指包括编码球等鞭金藻A9延长酶多肽 的核苷酸序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列。简并的变异体在本专利技术中是指编码具有SEQ ID N0:2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID N0:1所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。 非编码的衍生物还表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反义DNA。所述的反 义DNA属于本专利技术的无功能衍生物。如不具备酶促活性的衍生物。可用本领域的技术人员 熟知生产无功能衍生物的其它方法有共抑制，核糖酶和内含子的使用。4 本专利技术还涉及与以上所描述的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产ＤＨＡ的球等鞭金藻的Δ９延长酶的核苷酸序列，其特征在于它包括：　　（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的核苷酸序列，或　　（ｂ）与（ａ）所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
一种产DHA的球等鞭金藻的Δ9延长酶的核苷酸序列，其特征在于它包括(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2. 按照权利要求l所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是选自(a) 编码为SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列多肽的核苷酸序列；(b) 与核苷酸序列(a)互补的核苷酸序列；(c) 核苷酸序列(a)的核苷酸突变序列。3. —种多肽，其特征在于它是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。4. 一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明春，黎明，魏东盛，欧秀元，邢来君，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]