活化诱导胞苷脱氨酶(AID)突变体及使用方法技术

本发明专利技术提供了活化诱导胞苷脱氨酶(AID)蛋白的功能性突变体，与野生型AID蛋白相比其具有增加的活性。本发明专利技术还提供了编码所述功能性AID突变体的核酸，以及包含所述核酸的载体和细胞。本发明专利技术还提供了使用所述功能性突变AID蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】活化诱导胞苷脱氨酶(AID)突变体及使用方法相关申请的交叉引用本专利申请要求于2009年4月3日提交的美国临时专利申请第61/166，349号的权益，其援引加入本文。电子提交材料的援引加入同时提交的计算机可读取的核苷酸/氨基酸序列表整体援引加入本文，并且如下所示一个2010年4月1日创建的名为‘3equenceListing.TXT”的140，103字节的 ASCII(Text)文件。
技术介绍
产生抗体多样化的自然机制利用体细胞高变(SHM)的过程以引发免疫球蛋白可变区的进化，从而迅速产生与体液应答相关的第二抗体所有组成成分。在体内，SHM代表一个高效的过程，其能够迅速以代表抗体优化的自然过程的方式探索生产性折叠结构并进化出高亲和力抗体。因此，对于尝试在体外复制SHM有很大的兴趣，以便创造简单、稳健的方法，其能够直接在哺乳动物细胞环境内模拟亲和力成熟的自然过程以选择和进化免疫原性耐受并且在哺乳动物细胞中高表达的抗体(Cumbers et al.，Nat Biotechnol.， 20(11) :1129-1134(2002) ；Wang et al. , Prot. Eng. Des. Sel. , 17(9) :569-664(2004)； Wang et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 101 (48) :16745-16749(2004) ；Ruckerl et al.， Mol. Immunol. ,43(10) :1645-1652(2006) ；Todo et al. , J. Biosci. Bioeng. ,102(5) 478-81(2006) ；Arakawa et al.，Nucleic Acids Res. ,36(1) :eK2008))。然而，已从单个人或动物分离的天然抗体常不能证明最佳亲和力属性，因为免疫系统固有的内在亲和力上限阻止体内辨别并因此选择具有大于约IOOpM亲和力的抗体(Batista and Neuberger, Immunity,8(6) :751-91998, (1998)禾口 EMBO J. ,19(4) 513-20(2000)。使用噬菌体展示文库可以解决一些问题，并且已证实基于噬菌体展示的方法能够常规地产生高亲和力抗体。然而，从理论角度来看，这样的静态文库的大小和范围本质上是有限的，因为即使最大的(1012)文库仅可以探索小部分潜在的先天免疫组成成分。此外，不可以同时在良好的哺乳动物表达和高亲和力的基础上通过噬菌体展示方法共进化抗体，从而引起另外由在哺乳动物宿主细胞中低表达所导致的潜在的下游生产问题。此外，使用随机诱变结合噬菌体展示缺少在抗体亲和力成熟的自然过程中发现的内在选择性谱，这常导致人抗人免疫性或不期望的交叉反应性谱的问题。最初利用人伯基特淋巴瘤细胞系Ramos证实了在体外利用体细胞高变来使用培养细胞系进化特异性靶抗原的抗体(Cumbers et al. , Nat. Biotechnol. ,20(11) 11^-1134(2002))。Ramos和其他B细胞系还成功地用于进化随机整合入宿主细胞染色体 DNA 的非抗体基因(Wang et al.，Prot. Eng. Des. Sel. , 17(9) :569-664(2004)和 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,101(48) 16745-16749 (2004))。此外，利用有或无 Ig 特异性顺式调控元件的游离型载体在B细胞系中在非抗体基因上证实了高效的体细胞高变(Ruckerl etal.，Mol. Immunol.，43 (10) 1645-1652 (2006))。虽然一些 Ramos 细胞系表现出相对高的组成型高变率，但是B细胞系一般表现出相对低的细胞分裂速率并且难以高效转染，这限制了其用于定向进化的实际效用。鸡法氏囊细胞系DT40通过假V基因模板基因转换来多样化其重排的Ig轻基因。然而，如果基因转换被Rad51种内同源基因XRCC2的缺失(Sale et al. , Nature, 412 :921-6^001))或假基因转换供体的缺失(Arakawa et al.，Nucleic Acids Res., 36(1) :el (2008))阻断，该细胞系在培养中表现出组成型高变。与Ramos细胞相比，DT40 细胞具有明显更短的世代时间(12小时)，适合定向基因靶向并且成功用于内源抗体 (Seo et al.，Nat. Biotechnol.，23 (6) :731-5(2005) ；Nat. Protoc.，1 (3) :1502-6(2006)； Biotechnol. Genet. Eng. Rev. , 24 179-93 (2007) ；Todo et al. , J. Biosci. Bioeng., 102(5) :478-81(2006))和非抗体蛋白(Arakawa et al.，Nucleic Acids Res. ,36(1) el (2008))的定向进化。虽然诸如Ramos和DT40的B细胞衍生物成功用于定向进化，但是由于许多因素，在定向进化的稳健方法中可靠使用这些细胞是复杂的，所述因素包括(i)需要将所关注的基因插入宿主细胞Ig基因座中的确定位点以实现高水平诱变(Parsa et al. , Mol Immunol. ,44(4) :567-75 (2007)，和(ii)这些细胞中在内源性免疫球蛋白基因座发挥作用的体细胞高变的复杂的自然生物学。此外，这样的工程细胞系在SHM率中表现出显著的克隆不稳定性(Zhang et al.，Int. Immunol. , 13 :1175-1184(2001), Martin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,99(19) :12304-12308(2002)和 Nature，415 (6873) :802-806(2002)； Ruckerl et al.，Mol. Immunol. ,41 :1135-1143 (2004))，并且不提供任何简单的方法以调节或控制高变，即在完成期望表型的选择之后关闭诱变。许多研究组已成功描述了使用非B细胞在所关注的基因中启动靶向体细胞高变(Martin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 99 (19) :12304-12308(2002)和 Nature, 415(6873) :802-806(2002) ；McBride et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (23) 8798-803(2006) Jovanic et al.，PLoS ONE, 23 ；3(1) :el480(2008)；美国专利申请公开 09/0075378 ；国际专利申请公开WO 08/10;3474Α1和WO 08/103475A1)，而且这些细胞系还可以提供高效基因转移、高水平蛋白表达、最佳生长特征，并且很容易适合悬浮培养和流式细胞术。活化诱导胞苷脱氨酶(AID)属于胞苷脱氨酶的AP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·王，Z·杨，C·拉达，M·纽伯格，
申请(专利权)人：医学研究会，
类型：发明
国别省市：