新型2-脱氧青蟹肌糖合成酶制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种对于热和pH的稳定性等特性比现有的酶更优异的DOI合成酶，以及提供一种使用了该酶的DOI制造方法。根据本发明专利技术，可以提供一种具有下述(1)、(2)、(4)、(6)和(7)的特性、且具有下述(3)和/或(5)的特性的2-脱氧青蟹肌糖合成酶。(1)作用：本酶具有将葡萄糖-6-磷酸转换为2-脱氧青蟹肌糖的功能。(2)最适pH范围：7.0～7.7。(3)稳定pH范围：6.0～8.0。(4)最适温度范围：55～70℃。(5)稳定温度范围：20～46℃。(6)辅酶：利用NAD+。(7)分子量：39000～42000。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及耐热性2-脱氧青蟹肌糖合成酶、2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因、重组载体、转化体以及2-脱氧青蟹肌糖的制造方法。
技术介绍
目前，许多邻苯二酚等芳香族化合物是以石油为原料而进行生产的，但从石油资源枯竭的问题、削减二氧化碳排放量等方面出发，要求开发出利用生物物质的环境协调型的新型制造工艺。另一方面，有文献发现2-脱氧青蟹肌糖(以下称为D0I)能够转换为工业上有用的芳香族化合物(邻苯二酚等)(非专利文献1)，此外，有文献报道能够由作为生物物质的构成要素之一的葡萄糖来合成该DOI (非专利文献1)。在该DOI制造工艺中重要的是由葡萄糖-6-磷酸向DOI转换的2-脱氧青蟹肌糖合成酶(以下称为DOI合成酶)，DOI不仅能够转换为上述芳香族化合物，还能够成为各种有用化合物的中间体，因而DOI合成酶备受瞩目。DOI合成酶是于1997年由属于丁酰苷菌素生产菌环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)的微生物分离纯化的(非专利文献2)，随后其基因序列也被公开(专利文献1)。除此之外，迄今为止还发现了来自印度斯坦链异壁菌(Str印toalloteichus hindustanus) JCM3268株(非专利文献幻的DOI合成酶等。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2000-236881号公报非专利文献非专利文献1 tetrahedron Letters 41，1935-1938，2000非专利文献2:The Journal of Antibiotics 50 (5)，424-428，1997非专利文献3:The Journal of Antibiotics 59 (6)，358-361，200
技术实现思路
专利技术所要解决的课题但是，上述DOI合成酶的稳定性和比活性等各种特性并不令人满意，而且基本上没有进行与适合于数千吨规模的工业化制法的酶的分析和功能提高有关的研究。例如，来自属于环状芽胞杆菌的微生物的DOI合成酶(BtrC)在稳定性等方面存在很大的问题，来自印度斯坦链异壁菌JCM3268株的DOI合成酶的比活性明显较低，工业上难以利用。本专利技术所要解决的课题在于提供一种对于热和PH的稳定性等特性比现有的酶更优异的DOI合成酶，以及提供一种使用了该酶的DOI制造方法。用于解决课题的方案为了解决这些课题，本专利技术人进行了深入研究，结果发现了一种与现有的酶相比热和/或PH稳定性得到了提高的DOI合成酶，从而完成了本专利技术。S卩，本专利技术涉及以下所示的DOI合成酶、DOI合成酶基因、重组载体、转化体以及 DOI制造方法。 一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述(1)、(2)、(4)、(6)和(7)的特性， 且具有下述⑶和/或(5)的特性(1)作用本酶具有将葡萄糖-6-磷酸转换为2-脱氧青蟹肌糖的功能；(2)最适 pH 范围7. 0 7. 7;(3)稳定 pH 范围6. 0 8.0 ；(4)最适温度范围55 70°C ；(5)稳定温度范围20 46°C ；(6)辅酶利用 NAD+ ；(7)分子量39000 42000。如所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(8)的特性(8)比活性1. 0μ mol/min/mg 以上(反应温度 65°C )。如或所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(9)的特性(9)辅因子通过添加Co2+离子提高活性。如 的任一项所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，稳定温度范围为 20 60 。 一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述任一种氨基酸序列(a)序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列；(b)与序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有高温稳定性和/或宽范围PH稳定性的氨基酸序列；或(c)在序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列中包含1个或2个以上的氨基酸的缺失、添加、和/或置换，且具有高温稳定性和/或宽范围PH稳定性的氨基酸序列。 一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因，其具有编码下述任一种氨基酸序列的碱基序列(a)序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列；(b)与序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有高温稳定性和/或宽范围PH稳定性的氨基酸序列；或(c)在序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列中包含1个或2个以上的氨基酸的缺失、添加、和/或置换，且具有高温稳定性和/或宽范围PH稳定性的氨基酸序列。 一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因，其具有下述任一种碱基序列(a)序列号1、3、5、7、9或11的任一项记载的碱基序列；(b)与序列号1、3、5、7、9或11的任一项记载的碱基序列具有80%以上的同源性、 且编码具有高温稳定性和/或宽范围PH稳定性的2-脱氧青蟹肌糖合成酶的碱基序列；或(c)在序列号1、3、5、7、9或11的任一项记载的碱基序列中包含1个或2个以上的碱基的缺失、添加、和/或置换，且编码具有高温稳定性和/或宽范围PH稳定性的2-脱氧青蟹肌糖合成酶的碱基序列。 一种重组载体，其含有或所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因。 一种转化体，其是通过将或所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因或 所述的重组载体导入宿主中而得到的。 一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其是通过培养所述的转化体而得到的。 一种2-脱氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，该方法中使用 或 的任一项所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶。 一种2-脱氧青蟹肌糖的制造方法，该方法将葡萄糖、以葡萄糖为构成成分的多糖类和/或葡萄糖-6-磷酸作为原料来制造2-脱氧青蟹肌糖，其特征在于，该方法中利用或所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因、或者所述的转化体。 一种由葡萄糖-6-磷酸制造2-脱氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，在含有钴离子的培养基中培养能够表达2-脱氧青蟹肌糖合成酶的微生物。如所述的方法，其特征在于，该方法中使用含有以葡萄糖为构成成分的多糖类或者葡萄糖的原料。如或所述的方法，其中，2_脱氧青蟹肌糖合成酶为 的任一项所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶。专利技术的效果若使用本专利技术的DOI合成酶，则在DOI的制造中能够在高温条件下利用酶。此外， 在某些制造条件下，制造时不需要严格的温度管理等。另外，能够在DOI稳定的pH范围即酸性条件下制造D0I。此外，在某些制造条件下，制造时不需要严格的pH管理等。附图说明图1示出纯化DOI合成酶(D0IS-1)的最适pH范围(实施例3)。图2示出纯化DOI合成酶(D0IS-1)的稳定pH范围(实施例3)。图3示出纯化DOI合成酶(D0IS-1)的最适温度范围(实施例3)。图4示出纯化DOI合成酶(D0IS-1)的稳定温度范围(实施例3)。图5示出纯化DOI合成酶(D0IS-1)的稳定温度范围(实施例3)。图6示出纯化已知DOI合成酶(BtrC)的稳定温度范围(比较例1)。图7示出纯化已知DOI合成酶(BtrC)的稳定pH范围(比较例1)。具体实施例方式以下，对本专利技术进行具体说明。本专利技术的具体实施方式(以下称为本实施方式)的DOI合成酶具有下述特性(1)作用本酶具有将葡萄糖-6-磷酸转换为DOI的功能。(2)稳定性显示出高温稳定性和/或宽范围pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种２－脱氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述（１）、（２）、（４）、（６）和（７）的特性，且具有下述（３）和／或（５）的特性：（１）作用：本酶具有将葡萄糖－６－磷酸转换为２－脱氧青蟹肌糖的功能；（２）最适ｐＨ范围：７．０～７．７；（３）稳定ｐＨ范围：６．０～８．０；（４）最适温度范围：５５～７０℃；（５）稳定温度范围：２０～４６℃；（６）辅酶：利用ＮＡＤ＋；（７）分子量：３９０００～４２０００。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：小西一诚，今津晋一，
申请(专利权)人：旭化成化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP