本发明专利技术涉及一种利用蛋白质层析系统（ＦＰＬＣ）测定脱氧胞苷激酶（ｄＣＫ）酶活的方法，包括步骤：（１）３０℃～４０℃，将反应混合液放入气浴／水浴恒温振荡器中，１２０～１５０转／ｍｉｎ，反应２～３小时，加入冰甲醇终止反应，冰浴５～２０分钟后，离心，取上清液；（２）用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液稀释上清液，过滤，利用ＦＰＬＣ的反相液相色谱柱进行层析，通过与空白对比测得ＣｄＡ减少的量，计算ｄＣＫ的活性。该方法快速、简便，结果可信，重复性高，为大批量测定氧胞苷激酶（ｄＣＫ）酶活，提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于一种酶活力测定方法，具体涉及一种脱氧胞苷激酶(dCK)的酶活测定方法。
技术介绍
脱氧胞苷激酶(dCK)是细胞质内的四大激酶之一，它广泛存在于哺乳动物体内及一 些细菌细胞内。细胞体内，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷类药物的 磷酸化。研究表明，抗病毒核苷类药物在人体内通过dCK催化进行磷酸化，产生与逆转录 酶结合的底物，而发挥药效。但是，在一些患者体内细胞的dCK含量很低，无法催化核苷 类药物的磷酸化，因而导致了病毒的抗药性。因此，利用从各种来源提取dCK，并将其用 于核苷类似物的体外磷酸化，对核苷类药物的发展来说是一个崭新的领域。故对于从各种 来源纯化的dCK进行酶活表征，是利用dCK进行催化反应的重要步骤。自1970年以来，有多个专家对于dCK的酶活测定方法进行了研究，主要有放射性 同位素薄层层析色谱法、放射性同位素连续分光光度法以及非放射性反相HPLC色谱法。 其中，放射性同位素薄层层析色谱法的专利技术年代较早，对现代实验室测量来说是落后且费 时的；放射性同位素连续分光光度法虽然是第一种方法的改进，但是同样也需要用到放射 性同位素，大大增加了时间上和经济上的成本；而非放射性反相HPLC色谱法是2004年 发表的利用高效液相色谱进行dCK酶活测定的一种新方法，简单易懂，简化了以往的复杂 操作，但是其对液相色谱柱要求较高。通过实验发现，应用非放射性反相HPLC色谱法， 在相同条件下进行两次实验，所得的结果存在差异，实验重复性不够。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脱氧胞苷激酶(dCK)酶活测定方法，该方法克服了以往的 dCK酶活测定方法的繁琐，耗时较长，重复性不高的缺陷。本专利技术的利用蛋白质层析系统(FPLC)测定dCK酶活的方法，包括如下步骤(1) 将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中反应后，加入冰甲醇终止反应，冰浴后， 离心，取上清液；(2) 用Tris-HCI缓冲液稀释上清液，过滤，利用FPLC的反相液相色谱柱进行层析，通过 与空白对比测得CdA减少的量，计算dCK的活性。所述步骤(1)中的反应液包括2-氯-2-脱氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化 镁MgCl2、氯化钠NaCl、氟化钠NaF、 二硫代苏糖醇DTT、 dCK，浓度分别为0.1 lmmoI/L CdA、 1 1Ommol/LUTP、 l 10mmol/LMgCl2、 10 20mmol/LNaCl、 10 20mmol/LNaF、 1 2mmol/LDTT，优选lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 10mmol/L MgCl2、 20mmol/LNaCl、 20mmol/L NaF 、 2mmol/L DTT 。所述步骤(1)中的反应液用0.005 0.02mol/L的Tris-HCl (pH6.0 8.0)溶液定容， 优选0.01 moi/L的Tris-HCl (pH7.4);所述的脱氧胞苷激酶(dCK)是指从小牛胸腺中提取的dCK;所述步骤(1)中的反应是指30'C 4(TC， 120 150转条件下，反应2 3小时，反 应后冰浴5 20分钟，优选37°C，摇床转速为150转，反应时间为2小时，反应后冰浴 IO分钟;所述的歩骤(2)中的层析条件是反相液相色谱柱为RESOURCE" RPClml，洗脱液 A为0.05 0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH6.0 8.0)，洗脱液B为乙腈，平衡为5 10 个柱床，冲洗为5 7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B在10 20个柱床内由0%线性增加至 100%，流速为l 2ml，优选洗脱液A为O.Olmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，平衡为 10个柱床，冲洗为7个柱床，洗脱梯度为洗脱液B在20个柱床内由0%线性增加至100 %，流速为1ml;所述的dCK酶活的计算方法dCK酶活U=CdA反应量(picomol)/蛋白含量(u g) *h， CdA反应量二CdA空白标准量一CdA剩余量；所述的CdA剩余量的测定为内标法。本专利技术提供的方法快速、简便，结果可信，重复性高，为大批量测定氧胞苷激酶(dCK) 酶活，提供依据。附图说明图1为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反应混合液空白 进行反相色谱层析所得的色谱图2为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反应混合液进行 反相色谱层析所得的色谱图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一歩阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。实施例11 、 dCK催化CdA的单磷酸化反应(1) 将反应混合液包括lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 10mmol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/L DTT以及lmldCK用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4) 定容到5ml。(2) 将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中，在37'C、 150rpc下，反应2小时。(3) 反应完毕后将混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反应10分钟，另蛋白 质完全沉淀。(4) 从冰浴中取出混合液，放入离心机中10000rpc离心10分钟，留取上清液等待 FPLC测定。(5) 样品空白的准备在反应混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入气浴/水浴恒温 振荡器中，在37。C、 150rpc下，反应2小时。冰浴10分钟后，离心留取上清液。2、 FPLC测定dCK酶活(1) 样品的准备。取上述反应混合物清液0.5ml，用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液 (pH7.4)稀释至lml。将稀释的混合液用0.45y的滤头过滤，等待上样。(2) 反相液相色谱层析。用FPLC系统中反相液相色谱对上述处理过的样品和样品空 白进行层析，条件是反相层析柱RESOURCE RPC lml;洗脱液A: O.Olmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.0);洗脱液B:乙腈；上样量5ml;平衡IO个柱床；冲洗7个柱床；洗脱梯度洗脱液B在20个柱床内由0%线性转变到100%;流速lml/min。实施例21、 dCK催化CdA的单磷酸化反应(l)将反应混合液包括lmmol/LCdA、 10mmol/LUTP、 1 Ommol/LMgCl2、 20mmol/L NaCl、 20mmol/LNaF、 2mmol/L DTT以及lmldCK用O.Olmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.0) 定容到5ml。(2) 将反应混合液放入气浴/水浴恒温振荡器中，在37。C、 150rpc下，反应2小时。(3) 反应完毕后将混合液取出，加入lml冰甲醇，放入冰浴中反应10分钟，另蛋白 质完全沉淀。(4) 从冰浴中取出混合液，放入离心机中10000rpc离心10分钟，留取上清液等待 FPLC测定。(5) 样品空白的准备在反应混合液中直接加入lml冰甲醇，再放入气浴/水浴恒温 振荡器中，在37"C、 150rpc下，反应2小时。冰本文档来自技高网...
【技术保护点】
利用蛋白质层析系统（ＦＰＬＣ）测定脱氧胞苷激酶（ｄＣＫ）酶活的方法，包括如下步骤： （１）３０℃～４０℃，将反应混合液放入气浴／水浴恒温振荡器中，１２０～１５０转／ｍｉｎ，反应２～３小时，加入冰甲醇终止反应，冰浴５～２０分钟后，离心，取上清液； （２）用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液稀释上清液，过滤，利用ＦＰＬＣ的反相液相色谱柱进行层析，通过与空白对比测得ＣｄＡ减少的量，计算ｄＣＫ的活性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱利民，柴艳倩，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。