差异多肽检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种使用一亲和介质从待测样品中去除与对照样品中相似的蛋白/多肽而富集和检测在对照样品和待测样品之间有差异的蛋白/多肽的方法。通过该方法检测得到的差异蛋白/多肽在发现生物标志物和药物靶标，评估健康风险，及个性化用药和治疗方面提供了重要的信息。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请这个申请要求2009年5月21日申请的美国临时专利题目为“差异多肽检测方法及应用”(PROCESS FOR DIFFERENTIAL POLYPEPTIDES DETECTION AND USES THEREOF)，申请号61/180,310的优先权。本专利技术自始至终引用的所有专利、专利申请和相关文献组成完整的参考文献。专利
本专利技术提供了一种分析待测样品和对照样品之间差异多肽的方法和试剂，以及这些差异蛋白在个体化用药、诊断及药物研究开发方面的应用。专利技术背景基因组包含的“遗传蓝图”决定了每种生物的基因型以及对疾病的易感性或抵抗性。然而，很多常见慢性疾病的发作并不遵守孟德尔遗传规律而难以预测。这些疾病常常是由于还未确定的多基因与多种环境因子相互作用引起的。这些疾病包括冠状动脉心脏病、高血压、糖尿病、肥胖，各种癌症，阿尔茨海默病，帕金森病等。即使两个生物个体基因组相同，在发育和疾病发生的不同阶段、在不同器官和组织中也能够发育成为功能不同的细胞。对于人类来说，运动、饮食、社会交往、心理学和环境因子(例如：毒素)都对形成每个人独一无二的蛋白质谱都具有重要作用，这些独特的蛋白谱起因于多个基因和环境的相互作用。即使是同一个人，一个基因的表达在不同组织、器官或细胞中，以及在不同时间和环境控制下也可能有所不同。因此，认为个体的疾病发生和药物治疗效果完全取决于遗传因素是不符合实际的。个体化药物治疗除了检测基因、基因表达和代谢产物外，还必须检测蛋白质的变化。检测结果与药物反应、疾病状态、疾病预防或者疾病治疗，诊断相关，有助于医生针对每个患者进行个体化精确治疗。蛋白质的动态性质可以反映出个体实时的生理状态，有助于为患者在恰当的时间选择合适的治疗手段(恰当的药物和合适的剂量)要求更确切的诊断或预防疾病、判断疾病状态、评估风险后果，以及建立个性化治疗策略。癌症依然是全世界的致死率最高的疾病。癌症诊断过去一直基于癌症发病的身体器官或组织进行分类。然而，构成恶性肿瘤的细胞明显是不均一的，如已经发现白血病有～38种和淋巴瘤有～51种类型，仅用基因组信息差异难于解释其差异。尽管诊断技术、治疗手术和治疗方法都在进步，癌症患者长期生存率依然不容乐观，因为大部分的癌症发现时已经处于发展晚期，有些还存在远组织转移，这些因素都使治疗效果大打折扣。通过细胞表面和(或)细胞内关键蛋白质谱对患者进行诊断和分类提供的新信息能够反映癌细胞扩散速度、治疗方法的效果，进行尽可能早诊断的可能性，就可以在临床症状远未表现出来前进行干预和治疗。早期诊断和分类有助于了解临诊前期分子水平的变化和发现处于潜在风险中患者，避免过去采取的试错治疗策略，使医生能够一开始就选用副作用最小、疗效最好的药物。还可以研发临床诊断新方法，而现有检测都是针对具有统计学意义的生物标志物，无法检测具有未知风险的蛋白质信号。关键蛋白谱的检测和鉴定对加速人们理解疾病的生物过程是至关重要的，对疾病发生过程的理解又促进发现药物新靶点和疾病诊断新标志物。因此，表型或疾病相关的蛋白谱的鉴定在生物学和药学领域亦加重要。目前蛋白功能或疾病相关蛋白谱的检测策略是比较对照样品的蛋白谱。蛋白组分析核心技术有一/二维凝胶电泳和一/多维液相色谱，几乎都与质谱联用。然后比对不同样品蛋白谱间的差异。不同荧光染料如Cy2，Cy3，or Cy5标记样品的两维电泳共分析策略比并行分析/依次分析策略具有更高的重复性。一项重要改进是两维色谱分离样品后用同位素标记蛋白，通过质谱图比较分析差异。这种方法包括重同位素(例如15N，13C，和18O)掺入和同位素标记试剂，在专利WO01/94935；WO03/102220；US20050069961；US20050100956；US2002/0168644；美国专利6,670,194；WO03/102018和WO00/11208中都有描述。美国专利US20050074794描述了另一套标记多种样品的试剂、筛选和富集标记分子、分析及进行可靠比较的标准操作。另一个重要的改进是应用有限数目的免疫亲和方法去除多达20多种高丰度的血清蛋白，明显改善了低丰度蛋白的检测(Yocum AK et al.，J.Proteome Res.2005，4：1722-1731；Schuchard MD et al.，Origins 2005，21：17-23.)。然而，分析鉴定一个样品的完整蛋白表达谱的工作量仍然很大。通过基因拼接和翻译后修饰，人基因组中的约35,000基因能够表达出的蛋白种类可达100,000-500,000种，估计一个特定样品的蛋白组复杂性可达30,000-50,000种蛋白。环境、营养、发育环境都直接影响蛋白的动态表达，因此不同个体间或个体在不同环境下导致更高程度的分子复杂性和多样性。细胞、组织、血清等样品中存在的蛋白数目成千上万。当前技术缺乏可靠地、可重复地检测足够多种类蛋白质需要的分辨率。因此，需要一种更有效的方法来筛选、发现和鉴定样品间的差异蛋白。专利技术概述本专利技术提供了一种检测待测样品和对照样品间差异多肽的方法和试剂，以及这些差异蛋白在个体化用药、诊断及药物研究开发方面的应用。一方面，本专利技术提供了提高待测样品中至少一种蛋白或多肽浓度的方法，这种蛋白和多肽在待测样品和对照样品中存在差异，包括：(a)从生物对照样品中提取一种或多种可溶性蛋白或多肽，制备具有抗原结合能力的免疫球蛋白能够结合生物对照样品中至少一种多肽；(b)将免疫球蛋白固定到基质上，制成亲和介质；(c)从生物待测样品中提取可溶性蛋白或多肽；和(d)将从生物待测样品中提取的可溶性蛋白与亲和介质接触，收集未结合的样品，浓缩样品中富集的差异蛋白或多肽。一方面，本专利技术提供了一种提高待测样品中至少一种多肽浓度的方法，这种多肽在生物对照样品和实验样品间存在差异，包括：(a)从生物对照样品中提取一种或多种可溶性蛋白或多肽，制备具有抗原结合能力的免疫球蛋白，能够结合生物对照样品中至少一种多肽；(b)将免疫球蛋白固定到基质上，制成亲和介质；(c)从生物待测样品中提取可溶性蛋白或多肽；(d)将从生物待测样品中提取的可溶性蛋白流过装有亲和介质的层析柱，收集流穿样品，浓缩其中富集的差异蛋白或多肽。在一个优选的实例中，工艺还包括：(e)鉴定从待测生物样品中富集的多肽。在另一个优选实例中，富集的多肽利用质谱方法进行鉴定。另一方面，本专利技术提供了一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.05.21 US 61/180,3101.一种提高待测生物样品中至少一种蛋白或多肽浓度的方法，所述蛋白或
多肽在待测生物样品和对照生物样品中存在差异，所述的方法包括步骤：
(a)从一对照生物样品中提取一种或多种可溶性蛋白或多肽，并且制备能
够结合抗原的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能够结合所述对照生物样品中至少
一种多肽；
(b)将所述免疫球蛋白固定到一基础介质上，制成亲和介质；
(c)从一待测生物样品中提取可溶性蛋白或多肽；
(d)使从所述生物待测样品中提取的可溶性蛋白通过一装有所述亲和介质
的层析柱，收集流穿组分，并浓缩其中的蛋白，从而富集浓缩所述待测样品中
的差异蛋白或多肽。
2.如权利要求1所述的方法，所述的方法还包括步骤：
(e)鉴定所述待测生物样品中被富集的多肽。
3.如权利要求2所述的方法，所述被富集的多肽用质谱鉴定。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，所述结合抗原的多肽是抗体或抗体片
段，或者其组合。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣秀，
申请(专利权)人：李荣秀，
类型：发明
国别省市：