用于治疗DMD的包含肌苷的寡核苷酸制造技术

本发明专利技术提供了包含肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的寡核苷酸或其功能等同物，其中寡核苷酸或其功能等同物包括与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补的序列，所述部分为包括至少8个核苷酸的一段连续序列。本发明专利技术还提供了所述寡核苷酸用于预防或治疗DMD或BMD的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及分子生物学和医学领域。专利技术背景肌肉病症是通常对个体生活具有显著影响的疾病。肌肉病症可具有遗传因素或非遗传因素。具有遗传因素的一组重要的肌肉疾病为贝克型肌营养不良(Becker Muscular Dystrophy，BMD)和杜氏肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)。这些病症是由肌肉蛋白质的基因缺损引起的。贝克型肌营养不良和杜氏肌营养不良是具有相对高发病率的遗传性肌营养不良。在杜氏和贝克型肌营养不良中，肌肉蛋白质即肌营养不良蛋白受到影响。在杜氏肌营养不良中，不存在肌营养不良蛋白，然而在贝克型肌营养不良中，存在一些肌营养不良蛋白，但是肌营养不良蛋白的产生最常见是不足的和/或存在的肌营养不良蛋白是异常形成的。两种疾病都与隐性X连锁遗传有关。DMD起因于DMD基因中的移码突变。DMD基因转录物(mRNA)中的移码引起截短的非功能性肌营养不良蛋白蛋白质的产生，从而导致渐进性肌萎缩和无力。由于突变不引起DMD转录物(mRNA)移码，所以出现BMD。由于不同于不存在肌营养不良蛋白的DMD，BMD中存在有部分功能至大半功能的肌营养不良蛋白，因此BMD症状普遍没有DMD严重。DMD的发作早于BMD。DMD通常在幼童时期自己表现出来，BMD在青少年或成年早期表现出来。BMD的进展比DMD慢以及更难以预测。患有BMD的患者可活到成年中期或晚期。患有DMD的患者很少活过三十多岁。肌营养不良蛋白在肌纤维中发挥重要的结构作用，其连接细胞外基质和细胞骨架。N末端区域结合肌动蛋白，而C末端是肌营养不良蛋白糖蛋白复合物(DGC)的一部分，其跨越肌膜。不存在肌营养不良蛋白时，机械应力导致肌膜破裂，引起钙不受控制地流入肌纤维内部，从而触发钙激活的蛋白酶和纤维坏死。对于大多数遗传性肌营养不良而言，目前没有临床上适用的有效疗法可以利用。为了与遗传性肌营养不良作斗争，当前探讨了外显子跳跃技术。近来我们和其他人已经报道了关于基因疗法的有希望的结果，所述基因疗法旨在恢复来自mdx小鼠、GRMD狗(参考文献59)和DMD患者的细胞中肌营养不良蛋白前体mRNA的阅读框1-11。通过特定外显子的靶向跳跃，将DMD表型(缺乏肌营养不良蛋白)转化成较温和的BMD表型(有部分功能至大半功能的肌营养不良蛋白)。优选通过靶向剪接位点的一个或两个或外显子-内部序列的反义寡核糖核苷酸(AONs)的结合诱导外显子的跳跃。由于当两个剪接位点被剪接体复合物识别时，外显子仅仅被包含在mRNA中，所以认为剪接位点是AON的明显靶标。更优选地，使用一个或多个AON，其对参与外显子的正确剪接的一个或多个外显子序列的至少一部分是特异性的。使用对外显子46序列特异性的外显子-内部AON，以前我们就能在来自两个具有外显子45缺失的不同DMD患者的培养的肌管中调节剪接模式11。AON治疗后，外显子46被跳跃，其导致至少75％细胞中阅读框的恢复和肌营养不良蛋白合成的诱导。最近我们证明在人对照和患者肌肉细胞中使用外显子-内部AON也可对39个不同DMD外显子有效地诱导外显子跳跃1，2，11-15。因此，应用于肌营养不良蛋白基因上的外显子跳跃技术导致DMD患者中生成至少具有部分功能的-虽然较短-肌营养不良蛋白蛋白质。由于DMD是由功能失调的肌营养不良蛋白蛋白质引起的，所以预期一旦向DMD患者提供功能性肌营养不良蛋白蛋白质，就能充分地减轻DMD症状。然而，本专利技术洞悉即使外显子跳跃技术能诱导肌营养不良蛋白的合成，但通过合并肌苷和/或含有能在所述寡核苷酸中形成摆动碱基对的碱基的核苷酸，能更进一步改善用于外显子跳跃技术的寡核苷酸。
技术实现思路
寡核苷酸在第一方面中，提供了包含肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的寡核苷酸或其功能等同物，其中寡核苷酸或其功能等同物包含与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补的序列，所述部分为包含至少8个核苷酸的一段连续序列。在本专利技术的寡核苷酸中肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的用途非常吸引人，如下所说明。例如，肌苷为已知能与三个碱基即尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶配对的修饰碱基。肌苷为次黄嘌呤通过β-N9-糖苷键与核糖环(也称为呋喃核糖)连接时形成的核苷。肌苷通常存在于tRNA中，并且对于摆动碱基对中遗传密码的正确翻译是必不可少的。摆动碱基对为RNA二级结构中基本的G-U和I-U/I-A/I-C对。所述摆动碱基对的热力学稳定性可与沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)的热力学稳定性相比。摆动碱基对对于遗传密码的正确翻译是关键的。通过使用反密码子的第一个碱基中的修饰碱基对，遗传密码补偿三联密码子(64)的氨基酸(20)数目的不一致。类似地，当设计用于聚合酶链式反应的引物时，肌苷是有用的，因为它会与腺嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶无差别地配对。使用这种碱基的第一个优点允许设计跨过单核苷酸多态性(SNP)的引物，不用担心所述多态性会破坏引物的退火效率。因此在本发明中，这种碱基的使用允许设计可用于个体的寡核苷酸，所述个体在被本专利技术的寡核苷酸靶向的一段肌营养不良蛋白前体mRNA序列内具有SNP。在本专利技术的寡核苷酸中使用肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的第二个优点是，如果已经将其设计为与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的非外显子区域的至少一部分互补，所述部分为包含至少8个核苷酸的一段连续序列，那么所述寡核苷酸通常会含有CpG。寡核苷酸中CpG的存在通常与所述寡核苷酸提高的免疫原性有关(参考文献60)。这种提高的免疫原性是不希望的，因为它可引起肌纤维分解。预期在所述寡核苷酸中用相应的肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基替换一个、两个或更多个CpG，可提供具有降低的和/或可接受水平的免疫原性的寡核苷酸。可在动物模型中通过评价所述动物的肌肉活检中CD4+和/或CD8+细胞和/或炎性单核细胞浸润的存在而评价免疫原性。通过使用技术人员已知的标准免疫测定检测中和抗体和/或识别所述寡核苷酸的抗体的存在，也可在用本专利技术的寡核苷酸治疗的动物或人类的血液中评价免疫原性。通过比较治疗前或用具有至少一个肌苷和/或能形成摆动碱基对的碱基的相应寡核苷酸治疗的动物的相应肌肉活检中每个细胞类型的量，免疫原性的提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.04.24 EP 09158731.1;2009.04.24 US 61/172,5061.包含肌苷和/或含有能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的寡核苷
酸或其功能等同物，其中所述寡核苷酸或其功能等同物包含与肌营养不
良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分或肌营养不良蛋白前体mRNA的
非外显子区域的至少一部分互补的序列，所述部分为包含至少8个核苷
酸的一段连续序列。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述一段连续序列包含
肌营养不良蛋白前体mRNA外显子RNA的13-50个核苷酸，优选14-25
个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述外显子包括外
显子51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8、55、2、11、17、19、
21、57、59、62、63、65、66、69和/或75。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷
酸包含RNA，并且其中优选地，所述RNA含有修饰，优选2’-O-甲基
修饰的核糖(RNA)或脱氧核糖(DNA)修饰，或者其中所述寡核苷酸的所述
功能等同物包含肽核酸、锁核酸、吗啉代磷酸二酰胺或其任意组合，最
优选吗啉代磷酸二酰胺。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷
酸包含至少两个部分，其中第一部分包含具有至少8个、优选16-80个
连续核苷酸的寡核苷酸，所述连续核苷酸与所述至少两个外显子的第一
个互补，并且其中第二部分包含具有至少8个、优选16-80个连续核苷酸
的寡核苷酸，所述连续核苷酸与所述肌营养不良蛋白前体mRNA中第二
个外显子互补。
6.根据权利要求5所述的寡核苷酸，其中所述第一个和所述第二个
外显子在所述肌营养不良蛋白前体mRNA中被不与所述核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱迪思·克里斯蒂娜·塞奥多拉·万多伊特科姆，约瑟夫斯·约翰尼斯·德吉姆彼，勒德乌斯·约翰尼斯·普拉滕伯格，
申请(专利权)人：普罗森那技术公司，
类型：发明
国别省市：