一种检测β-内酰胺酶的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测β-内酰胺酶的试剂盒及方法。试剂盒包括微孔试剂、酶测试剂和试纸，所述微孔试剂中冻干有头孢类药物特异性-胶体金标记物，所述酶测试剂中冻干有青霉素药物，所述头孢类药物特异性抗体为头孢类药物单克隆抗体或头孢类药物多克隆抗体；所述试纸由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，依次连接组成，所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体。所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有头孢类药物和载体蛋白的偶联物，质控区包被有抗抗体。用本发明专利技术试剂盒检测β-内酰胺酶的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测β -内酰胺酶的试剂盒及方法。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，动物源食品中的药物残留日益受到国际社会的重视。 内酰胺类抗生素作为发现最早、用量最多的一类抗生素，在牛乳及动物组织中残留检出报道最多。内酰胺类抗生素是指化学结构中含有内酰胺环的一类抗生素，主要包括青霉素类和头孢菌素类，其作用特点是能够抑制细菌黏肽转肽酶的活性，从而阻止细菌细胞壁的合成，呈现杀菌活性。在动物生产中，内酰胺类抗生素广泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。更为重要的是，抗生素被过量食入健康人肠道，会破坏健康人的正常菌群环境，导致人体免疫力的降低，从而危害消费者的身体健康。目前市场上出现了 “生鲜牛乳抗生素分解剂”，该分解剂的主要成分是β -内酰胺酶，在我国内酰胺酶是不允许使用的食品添加剂，严禁将内酰胺酶加入到有抗生素的奶中用于分解抗生素。目前对内酰胺酶常用的检测方法主要有液相法及微生物法， 但是液相法虽然准确度高，但是存在操作复杂，对检测人员要求高，检测时间长，成本高等缺点，微生物检测方法成本低，但是检测灵敏度低，容易出现假阳性，耗时长，不适合现场使用。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测β -内酰胺酶的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒包括微孔试剂、酶测试剂和试纸，酶测试剂和微孔试剂均具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物，所述酶测试剂中冻干有青霉素药物； 头孢类药物特异性抗体可为头孢类药物单克隆抗体或头孢类药物多克隆抗体；反应膜上包被有检测区和质控区；当头孢类特异性抗体为头孢类药物单克隆抗体时，检测区包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体；当头孢类药物特异性抗体为头孢类药物多克隆抗体时，检测区包被头孢类药物-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗兔抗抗体。所述保护膜粘贴在试纸两端，其中一端粘贴在样品吸收垫上，为检测端，上面有 MAX标记线，另一端粘贴在吸水垫上为手柄端。所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一侧，所述质控区位于远离所述有 MAX标记线的保护膜的一侧。所述头孢类药物-载体蛋白偶联物是由头孢类药物与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。所述头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物中的头孢类药物特异性抗体是以头孢类药物-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。所述底板可由不吸水的韧性材料制成，如硬质塑料、不吸水硬纸，具体可为PVC板材；样品吸收垫可为吸滤纸或虑油纸；吸水垫为滤纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或为纯纤维素膜；所述保护膜可为PE材质的保护膜。本专利技术的另一个目的是提供了一种制备上述试剂盒的方法，其包括步骤1)制备冻干有头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；2)制备冻干有青霉素药物的酶测试剂；3)制备具有包被头孢类药物-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；4)将3)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸5)将1) ,2)和幻制备好的微孔试剂、酶测试剂和试纸组装成试剂盒。具体的说，步骤包括1)将头孢类药物与载体蛋白偶联，形成头孢类药物-载体蛋白偶联物；2)用头孢类药物-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌头孢类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用头孢类药物-载体蛋白免疫兔，得到头孢类药物多克隆抗体；3)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔抗抗体；4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5)将制备的头孢类药物特异性抗体加入到制备的胶体金中，得到头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物；6)将头孢类药物特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂微孔中后，将微孔试剂加上微孔塞；7)将青霉素药物冻干到酶测试剂微孔中；8)将样品吸收垫用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0. 5% (体积百分含量))、PH为7. 2,0. lmol/L磷酸盐缓冲液浸泡池，在37°C下烘干池；9)在底板上按顺序贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；10)将制备好的微孔试剂、酶测试剂和试纸装入组装成试剂盒，2_8°C条件下保存 6个月本专利技术的另一个目的提供了一种牛奶样本中内酰胺酶的检测方法。用本专利技术上述任一所述试剂盒进行检测。本专利技术试剂盒的检测原理将待检样本液滴加于酶测试剂，混勻后，40°C 50°C 保温25min，后室温回温10 15min，将回温后的酶测试剂滴加于微孔试剂条中，混勻，孵育 5min，将标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液含有中β -内酰胺酶，则β -内酰胺酶分解酶测试剂中青霉素药物，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上头孢类药物-载体蛋白偶联物结合，检测区显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控区显色；若待检样品液中不含有内酰胺酶很低，则酶测试剂中的青霉素不会被分解，则扩散过程中青霉素药物可与金标抗体结合，进而完全封闭金标抗体上内酰胺类抗生素的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上偶联头孢类药物载体蛋白，检测区不显色。如果质控区不显色，则试纸失效。如图3所示。阴性当质控区(C)显示出红色条带，而检测区⑴不显色，判为阴性，用“_”表7J\ ο阳性当质控区(C)显示出红色条带，而检测区⑴显色，判为阳性，用“ + ”表示。无效当质控区(C)不显示红色条带，则无论检测区⑴是否出现红色条带，试纸均失效。本专利技术的试剂盒具有敏感度高、特异性高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的头孢类药物单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本专利技术试剂盒检测内酰胺类抗生素的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易推广使用。附图说明图1为试纸剖面结构示意图。图2为试纸的俯视图。图3为试纸检测结果判定图。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、检测β -内酰胺酶的试剂盒的构成一、微孔试剂 所述微孔试剂上具有微孔塞；所述微孔试剂上冻干有胶体金标记的头孢类药物单克隆抗体，包被量 0. 15-0. 20μ g/ml。二、酶测试剂所述酶测试剂微孔板具有微孔塞；所述酶测试剂微孔板上冻干有青霉素药物，包被量0. 15-0. 20 μ g/ml。二、试纸(称作试纸条)(图1)所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上， 样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，万宇平，冯才伟，冯静，汪善良，罗晓琴，何丽霞，赵正苗，冯才茂，崔海峰，李勇，王建霞，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：