本发明专利技术涉及一种通过诱导增加拷贝数的质粒载体及其构建方法，该重组质粒，包括载体及基因片段，所述的载体含有两个复制起始点，分别为F因子复制起始点和噬菌体P1裂解复制起始点；所述的基因片段包括含有启动子和终止子的反密码子为琥珀突变(TAG)，非保守区为随机突变，来源为詹氏甲烷球菌属或酵母属的tRNA。本发明专利技术中所述的重组质粒可应用于筛选正交性琥珀抑制性tRNA分子，该方法与现有技术相比，更快速，更高效，更直观，更适合大容量的tRNA突变文库筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种通过诱导增加拷贝数的质粒载体及其构建方法，属于基因工程
，国际专利分类为C12N 15/69。
技术介绍
近二十年来，一种遗传密码扩充技术突破了在生物体内由20种天然氨基酸编码蛋白质的限制，从而使含有非天然基团氨基酸(unnatural amino acids，UAAs)的蛋白质分子能够得以在大肠杆菌，酵母，哺乳动物中表达出来。遗传密码扩充技术的核心在于设计筛选获得一对特异性正交氨酰tRNA合成酶和tRNA系统(orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNAsystem)，并利用“空白密码子”如琥珀密码子TAG等作为非天然氨基酸的编码密码子。正交性的涵义是指该正交氨酰tRNA合成酶仅特异性的将特定非天然氨基酸酰化到该正交tRNA上，而不会催化天然氨基酸的氨酰化反应；该正交tRNA仅能够被该正交氨酰tRNA合成酶所识别，而不会被内源性氨酰tRNA合成酶所识别。该技术的方法包括 设计建立一个基于氨酰tRNA合成酶活性位点的合成酶突变文库和一个基于tRNA非保守区位点的tRNA突变文库，通过对文库进行筛选从而获得针对特定非天然氨基酸的正交氨酰 tRNA合成酶和tRNA系统。文库的传统筛选方法为氯霉素法。氯霉素法原理为将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因中的一个非活性位点突变为琥珀密码子TAG，若氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸酰化到tRNA上，并由该氨基酰化的tRNA将氨基酸引入到氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因中的琥珀密码子TAG上，则全长氯霉素乙酰转移酶被翻译表达，宿主菌在加入了氯霉素的培养基中存活；若氨酰tRNA合成酶不能将非天然氨基酸酰化到tRNA上，则氯霉素乙酰转移酶基因的翻译在琥珀密码子TAG终止，全长氯霉素乙酰转移酶不能表达，宿主菌在加入了氯霉素的培养基中死亡。基于该原理，筛选出的单菌落在以下情况下具有正交性在加入了非天然氨基酸和氯霉素的培养基中存活，同时在不加入非天然氨基酸加入氯霉素的培养基中死亡。本专利提供了一种双复制子调控的质粒的构建及其在筛选正交tRNA 中的应用。本专利筛选方法的原理为高水平转录的异源tRNA如果被内源性氨酰tRNA合成酶识别将导致宿主菌的死亡。若tRNA突变文库中的tRNA被宿主菌体内的内源性氨酰 tRNA合成酶识别，同时该tRNA的转录丰度很高，则导致宿主菌死亡，从而正交性差的tRNA 被筛选除去；若tRNA突变文库中的tRNA不被宿主菌体内的内源性氨酰tRNA合成酶识别， 即使tRNA的转录丰度很高，菌株存活。本专利中构建的重组质粒是一种可诱导的双复制子调控的质粒，在没有诱导剂如IPTG的存在下，质粒的复制起始点为F因子复制起始点，该复制起始点是严谨型低拷贝复制起始点；在诱导剂IPTG存在条件下，Pl裂解复制起始点被启动从而发挥作用，该复制起始点是高拷贝复制起始点。通过这种可诱导的双复制子调控的质粒来调控异源tRNA的转录丰度，利用该质粒进行的筛选方法较氯霉素筛选法更快速，更高效，更直观，适合大容量的tRNA突变文库的筛选。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是构建一种双复制子调控的重组质粒。所述的重组质粒，包括载体及基因片段，所述的载体含有两个复制起始点，分别为F因子复制起始点和噬菌体Pl裂解复制起始点。所述的F因子复制起始点包括严谨型低拷贝复制起始点oriS和DNA解旋酶R印E 基因，RepE基因的登录号为1263M7。所述的Pl裂解复制起始点oriL为高拷贝复制起始点，其复制起始严格受控制于一种复制起始蛋白质R印L，RepL基因的登录号为2777395。所述的复制起始蛋白质R印L由大肠杆菌乳糖启动子控制。所述的基因片段为反密码子为琥珀突变(TAG)，非保守区为随机突突变的tRNA基因。所述tRNA基因来源于詹氏甲烷球菌属或酵母属。所述的tRNA基因的启动子和终止子为大肠杆菌脯氨酸转运RNA的启动子和终止子。所述的重组质粒的构建方法，包括以下工序LpF质粒构建全基因合成法合成一段基因，其序列包括DNA解旋酶R印E基因和oriS基因，插入用双酶切的质粒PET28a中，转化大肠杆菌，用卡那霉素筛选单克隆，即可；2.pFPl质粒构建全基因合成法合成一段基因，其序列包括大肠杆菌乳糖启动子基因，复制起始蛋白质R印L基因和oriL基因，插入用双酶切的质粒pF中，转化大肠杆菌，用卡那霉素筛选单克隆，即可；3. pFPl-tRNA 质粒构建根据tRNA序列设计引物，重叠PCR(overlapping PCR)法扩增，回收450bp的PCR 产物，插入用双酶切的质粒PFPl中，转化大肠杆菌，即可。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供使用上述重组质粒筛选正交tRNA的方法。在引入非天然氨基酸的正交氨酰tRNA合成酶和tRNA系统中，需要通过分别对氨酰tRNA合成酶和tRNA进行筛选，以获得高度正交的氨酰tRNA合成酶和tRNA分子对。本专利技术提出的筛选tRNA的方法原理为高水平转录的异源tRNA如果被内源性氨酰tRNA合成酶识别，将导致宿主菌的死亡。将本专利技术的重组质粒转化大肠杆菌，在IPTG存在的条件下， 重组质粒的拷贝数将从原来< 10增加至> 100，由此异源tRNA的丰度将大大提高如果该 tRNA被内源性氨酰tRNA合成酶识别，则宿主菌死亡，表现为转化无菌落生长；如果该tRNA 不被内源性氨酰tRNA合成酶识别，则宿主菌存活，表现为转化生长出单菌落。本专利技术所要解决的第三个技术问题是对筛选得到的正交tRNA进行效率检测。筛选得到的正交tRNA的效率通过β -半乳糖苷酶活性进行检测。构建一个检测质粒ρΤ 该载体含正交氨酰tRNA合成酶基因和在活性位点进行了琥珀突变的β -半乳糖苷酶基因。将重组质粒PFPl-tRNA和检测质粒ρΤ共转化大肠杆菌。加入特定非天然氨基酸的条件下，β-半乳糖苷酶活性越高，则正交tRNA效率越高，反之则越低。不加入特定非天然氨基酸的条件下，β -半乳糖苷酶活性越低，则tRNA正交性越高，反之则越低。附图说明图1为重组质粒pFPl-tRNA示意图。图2为双酶切鉴定重组质粒pF。图3为双酶切鉴定重组质粒pFPl。图4为双酶切鉴定重组质粒pFPl-tRNA。图5为正交tRNA的筛选。图6为正交tRNA效率检测。在图1中1为卡那霉素基因片段；2为大肠杆菌脯氨酸转运RNA的启动子；3 为tRNA基因片段；4为大肠杆菌脯氨酸转运RNA的终止子；5为大肠杆菌乳糖启动子；6 为R印L基因片段和oriL基因片段；7为R印E基因片段；8为oriS基因；9为重组质粒 pFPl-tRNA。在图2中M1为MarkerlKb ；1为重组质粒pF ；2为重组质粒pF用Eco57和BglI 双酶切后的酶切产物。在图3中Ml为MarkerlKb ；4为重组质粒pFPl ；3为重组质粒pFPl用XbaI和 BglII双酶切后的酶切产物。在图4中M2为Marker2 ；Ml为MarkerlKb ；6为重组质粒pFPl-tRNA ；5为重组质粒pFPl-tRNA用DraIII和HindIII双酶切后的酶切产物。在图5中1为没有添加ImM IPTG的培养皿内菌落生长情况；2为添加ImM IPTG 的培养皿内菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田浤，姚文兵，刘静娴，高向东，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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