具有抗微生物活性的多肽制造技术

本发明专利技术涉及具有抗微生物活性的分离的多肽。本发明专利技术还涉及编码所述多肽的多核苷酸；和包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有抗微生物活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。 本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。
技术介绍
本专利技术的目标是提供具有改善的抗微生物活性的多肽。所述多肽可呈现减少的溶血活性和/或减少的细胞毒性。所述多肽还可呈现对阳离子如Ca2+、Mg2+、Na+的减少的敏感性。所述多肽还可与其他抗微生物多肽相比呈现不同的和有利的抗微生物谱。
技术实现思路
本专利技术涉及具有抗微生物活性的分离的多肽，选自下组(a)包含SEQ ID NO 1的氨基酸1至40的多肽；(b) (a)具有抗微生物活性的片段。本专利技术还涉及编码本专利技术多肽的多核苷酸，并涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞。本专利技术还涉及产生此类具有抗微生物活性的多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下，培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本专利技术还涉及使用本专利技术的多肽和多核苷酸的方法。定义抗微生物活性术语“抗微生物活性”于本文定义为一种能够杀死微生物细胞或抑制微生物细胞生长的活性。在本专利技术的上下文中，术语“抗微生物的”系意欲意指有杀细菌的和/或抑制细菌的和/或杀真菌的和/或抑制真菌的效果和/或杀病毒的效果，其中术语“杀细菌的”应被理解为能够杀死细菌细胞。术语“抑制细菌的”应被理解为能够抑制细菌的生长，即抑制生长的细菌细胞。术语“杀真菌的”应被理解为能够杀死真菌细胞。术语 “抑制真菌的”应被理解为能够抑制真菌生长，即抑制生长的真菌细胞。术语“杀病毒的”应被理解为能够使病毒失活。术语“微生物细胞”代表细菌或真菌细胞(包括酵母)。在本专利技术的上下文中，术语“抑制微生物细胞的生长”意欲指细胞处于非生长状态，即它们不能繁殖。在一个优选的实施方案中，术语“抗微生物活性”系定义为杀细菌的和/或抑制细菌的活性。更优选地，“抗微生物活性”定义为针对葡萄球菌属(Staphylococci)(优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))的杀细菌的和/或抑制细菌的活性。就本专利技术而言，抗微生物活性可根据由Lehrer等，Journal oflmmunologicalmethods, Vol. 137 (2) pp. 167-174(1991)所述的方法测定。或者， 抗微生物活性可根据来自CLSI(临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)；之前称为国家临床与实验室标准委员会(Naional Committee ofClinical and Laboratory Standards))的 NCCL S 指南测定。具有抗微生物活性的多肽以浓度为500 μ g/ml ；优选浓度为250 μ g/ml ；更优选浓度为100 μ g/ml ；甚至更优选浓度为50 μ g/ml ；最优选浓度为25 μ g/ml ；且特别是浓度为 10 μ g/ml的具有抗微生物活性的多肽在相关微生物生长底物中于37°C温育16小时后(优选8小时后，更优选4小时后，最优选2小时后)可将金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的活细胞数目减少至1/100。具有抗微生物活性的多肽当以500 μ g/ml的浓度加入；优选当以250 μ g/ml的浓度加入；更优选当以100 μ g/ml的浓度加入；甚至更优选当以50 μ g/ml的浓度加入；最优选当以10 μ g/ml的浓度加入；以及特别是当以5 μ g/ml的浓度加入时，在相关微生物生长底物中于37°C也可将金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的长出(outgrowth)抑制8小时。本专利技术的多肽具有至少20 %，优选至少40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %， 更优选至少70 %，更优选至少80 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选至少 100%的由 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQID NO :3 或 SEQ ID NO :4 的氨基酸 1 至 40 所示的氨基酸序列组成的多肽的抗微生物活性。分离的多肽术语“分离的多肽”用于本文指至少20%纯的，优选至少40%纯的， 更优选至少60%纯的，甚至更优选至少80%纯的，最优选至少90%纯的，且甚至最优选至少95%纯的多肽，如通过SDS-PAGE所测定的。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”于本文代表一种多肽制备物，其含有以重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，至多 3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多1 %，且甚至最优选至多0. 5 %的与其天然结合的其它多肽材料。因此，优选地，基本上纯的多肽按该制备物中存在的总多肽材料的重量计为至少92 %纯的，优选至少94 %纯的，更优选至少95 %纯的，更优选至少96 %纯的，更优选至少 96 %纯的，更优选至少97 %纯的，更优选至少98 %纯的，甚至更优选至少99 %，最优选至少 99. 5%纯的，且甚至最优选100%纯的。本专利技术的多肽优选为基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上 (essentially)纯的形式”，即所述多肽制备物基本上不含与其天然结合的其他多肽材料。 这可以通过以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该多肽来完成。本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性” 描述。就本专利技术而言，两个氨基酸序列的比对是通过使用来自EMBOSS包(http:// emboss, org)的Needle程序(版本2. 8. 0)来确定的。所述Needle程序执行Needleman, S. B. ^P Wunsch, S. D. (1970) J. Mol. Biol. 48 :443_453中所述的全局比对算法。使用的取代矩阵为BL0SUM62，缺口开放罚分为10，而缺口延伸罚分为0.5。本专利技术氨基酸序列(如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的氨基酸1至40)与不同氨基酸序列之间的同一性程度计算为两个序列的比对中精确匹配数除以本专利技术序列的长度(氨基酸残基数)；或者，使用Needle标记为“最长同一性”的输出作为百分比同一性并计算如下 (相同的残基XlOO)/(比对的长度-比对中的缺口数)。结果表示为同一性百分比。多肽片段术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO=I或其同源序列的氨基和 /或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽；其中所述片段具有抗微生物活性。在一个实施方案中，所述片段含有SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4的至少34个，优选至少35个，更优选至少36个，甚至更优选至少37个，最优选至少38个并特别地至少39个连续氨基酸。基本上纯的多核苷酸术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物， 其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种具有抗微生物活性的多肽，选自下组：（ａ）包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的氨基酸序列的多肽：Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｘａａ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｘａａ－Ｈｉｓ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｘａａ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｙｒ；其中位置１４的Ｘａａ是Ａｒｇ或Ｌｙｓ；位置１７的Ｘａａ是Ａｓｎ或Ａｒｇ；位置２６的Ｘａａ是Ａｒｇ或Ｌｙｓ；位置３６的Ｘａａ是Ｖａｌ或Ｌｅｕ；和（ｂ）（ａ）的具有抗微生物活性的片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：莱昂纳多德玛利亚，
申请(专利权)人：诺维信阿德宁生物技术公司，
类型：发明
国别省市：DK