重组人Ｇ－ＣＳＦ的改进的加工制造技术

一种包括信号肽和Ｇ－ＣＳＦ肽的Ｇ－ＣＳＦ前体，其中，所述信号肽具有人Ｇ－ＣＳＦ／ｂ分子中的人野生型信号肽的序列，且该序列具有至少以下突变之一：Ｇｌｕ２９的删除、Ｇｌｕ２６的插入、Ｌｙｓ１１Ｌｅｕ的取代、Ｈｉｓ２１Ｐｈｅ的取代，以及Ｇｌｕ２８Ｌｅｕ的取代。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组人G-CSF的改进的加工
技术介绍
G-CSF是一个20kDa的糖蛋白，该糖蛋白由两个链内的二硫键稳定，含有单个氧-连接的碳水化合物部分(carbohydrate moiety)。成熟的G-CSF有174个氨基酸。G-CSF 是由骨髓细胞、巨噬细胞和成纤维细胞合成的。它的主要功能是作为中性粒细胞及其前体细胞的生长和分化因子。现有技术中还已知G-CSF活化成熟的中性粒细胞。此外，它刺激其它多种造血祖细胞的生长/分化(与另外的造血生长因子协同作用)并促进内皮细胞的增殖和迁移。在临床上，G-CSF被用于治疗中性粒细胞水平上的缺陷(例如，由癌症/化疗、 AIDS或骨髓移植导致的中性粒细胞减少症)。
技术实现思路
为了使用与人相同的G-CSF治疗中性粒细胞减少症患者，用编码人野生型G-CSF 的质粒转染人细胞。从所选克隆的细胞培养上清液中纯化G-CSF后，观察到大量的分泌的 G-CSF的N端被截短了 3个氨基酸。所述截短并不是克隆特异的，也不能通过改变细胞培养条件而消除。在上述观察的基础上，推断出细胞中，特别是HEK293F细胞中的G-CSF前体蛋白的加工(processing)并不精确。具体地，可推断出，为了在生理上去除所述信号肽，信号肽酶复合物并不只在预期的位点切割，该信号肽酶复合物还在另外一个位点进行切割，导致N 端的截短。令人惊讶地发现，如果使用了修饰的信号肽及相应的G-CSF前体，可以减少N端的截短。因此，在一个实施方式中，本专利技术提供包括信号肽和G-CSF肽的G-CSF前体，其中， 所述信号肽具有人G-CSF/b分子中的人野生型信号肽的序列(SEQ ID NO :4)，且该序列具有至少以下突变之一-Glu29 的删除，-Glu26 的插入，-LysllLeu 的取代，-His2IPhe 的取代，以及-Glu28Leu 的取代。在一个优选的实施方式中，所述G-CSF前体具有至少2个、或至少3个、或至少4 个、或所有5个上述突变。在本专利技术另一个实施方式中，所述G-CSF前体至多可以具有另外3个突变，所述突变选自插入、删除及取代。本专利技术另一个实施方式是编码本专利技术的G-CSF前体的多核苷酸，以及与上述多核苷酸互补的多核苷酸。本专利技术另一个实施方式是包括本专利技术的多核苷酸的载体，以及含有本专利技术的多核苷酸或本专利技术的载体的经转染的细胞。在一个优选的实施方式中，所述经转染的细胞是真核细胞，优选是人细胞，更优选是HEK293细胞，更进一步优选是HEK293F细胞或HEK293F衍生细胞(HEK293F derived cell)0在一个实施方式中，所述转染是瞬时的，在另一个实施方式中，所述转染是稳定的。本专利技术另一个实施方式是表达G-CSF的方法，该方法包括以下步骤-在合适的培养基中，培养本专利技术的经转染的细胞；-从所述培养基中分离G-CSF。在一个优选的实施方式中，在pH为6. 8-7. 5、优选为7. 1-7. 3、更优选为7. 2左右的条件下进行所述培养。优选在培养过程中控制所述PH。在另一个实施方式中，在胰岛素浓度为5-25mg/ml、优选为15_25mg/ml、更优选为 15-20mg/ml的条件下进行所述培养。令人惊讶地，采用本专利技术的修饰的信号肽，所产生的G-CSF的截短比率极小，优选低于分子的5%，更优选低于总G-CSF的1%。被认为是检测限。优选地，所述培养基不含血清。大部分G-CSF的糖基化类型没有改变，且活性与野生型G-CSF的活性相同。因此，本专利技术的方法产生了高度适于制药应用的G-CSF。附图说明图1显示了用TargetP程序对具有野生型信号肽的人野生型G-CSF的分析。图2显示了用TargetP程序对具有SP9信号肽的人野生型G-CSF的分析。图3显示了用TargetP程序对具有SPlO信号肽的人野生型G-CSF的分析。图4显示了采用构建体的HEK293F细胞中成熟G-CSF蛋白的表达，所述构建体分别编码具有野生型信号肽(表达水平是100% )、SP9信号肽或SPlO信号肽的前体蛋白。图5显示了具有SP9信号肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸测序(Edman降解法)的色谱图。图如-如对应于残基1-5。下面的表格中给出了所述氨基酸序列分析的总结ο图6显示了具有SPlO信号肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸测序(Edman降解法)的色谱图。对应于残基1-5。下面的表格中给出了所述氨基酸序列分析的总结O图7显示了格拉诺赛特(GRAN0CYTE)的氨基末端氨基酸测序(Edman降解法)的色谱图。图6a_6e对应于残基1-5。下面的表格中给出了所述氨基酸序列分析的总结。图8显示了具有野生型信号肽的人野生型G-CSF的氨基末端氨基酸测序(Edman 降解法)的色谱图。图7a_7e对应于残基1-5。下面的表格中给出了所述氨基酸序列分析的总结。图9显示了从用G-CSF SP9稳定转染的克隆分离中得到的两个示例性的克隆中全长G-CSF的比率的比较。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。 全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短彡相关，这是该分析的检测下限。图10显示了在搅拌釜反应器中，用不同培养pH培养的克隆1的实施例中全长4G-CSF的比率的比较。克隆1从用G-CSF SP9载体稳定转染的克隆分离中得到。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。摇瓶中的克隆1的参比培养(没有控制pH)中的全长G-CSF的比率表示于第一个灰色的棒中。全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短< 相关，这是该分析的检测下限。图11显示了在搅拌釜反应器中，用不同培养pH培养的克隆2的实施例中全长 G-CSF的比率的比较。克隆2从用G-CSF SP9载体稳定转染的克隆分离中得到。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。摇瓶中的克隆2的参比培养(没有控制pH)中的全长G-CSF的比率表示于第一个灰色的棒中。全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短< 相关，这是该分析的检测下限。图12显示了具有不同胰岛素浓度的培养基中，克隆2的实施例中全长G-CSF的比率的比较。克隆2从用G-CSF SP9载体稳定转染的克隆分离中得到。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短< 相关，这是该分析的检测下限。图13显示了在大规模的高细胞密度模式下培养、并在不同时间采集的克隆2的实施例中全长G-CSF的比率的比较，其中，培养基中含15mg/L的胰岛素，没有控制pH。克隆2 从用G-CSF SP9载体稳定转染的克隆分离中得到。所述剩余的非全长片断主要包括N端被截短3个氨基酸的G-CSF。全长G-CSF的比率为99%处的线与N端的截短彡相关，这是该分析的检测下限。实施例实施例1为了正确的蛋白加工，对所述G-CSF前体肽进行的优化所述野生型的人G-CSF的亚型b的cDNA已在GenBank数据库中公开(NM_172219)。 基本上，具有任何源自NM_172219的序列的任何G-CSF前体蛋白都可用于本专利技术的信号肽序列的修饰。在一个示例性的实施方式中，所述前体蛋白具有下文所示的如SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种包括信号肽和Ｇ－ＣＳＦ肽的Ｇ－ＣＳＦ前体，其中，所述信号肽具有人Ｇ－ＣＳＦ／ｂ分子中的人野生型信号肽的序列，所述序列具有至少以下突变之一：－Ｇｌｕ２９的删除，－Ｇｌｕ２６的插入，－Ｌｙｓ１１Ｌｅｕ的取代，－Ｈｉｓ２１Ｐｈｅ的取代，以及－Ｇｌｕ２８Ｌｅｕ的取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡罗拉·施罗德，
申请(专利权)人：奥克塔法马生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE