抗体纯化制造技术

本发明专利技术涉及应用疏水相互作用层析联用层析纯化抗体分子蛋白。该过程可顺序包括蛋白Ａ亲合层析、离子交换层析和疏水相互作用层析的步骤。纯化的无免疫球蛋白聚集体，错误折叠种类，宿主细胞蛋白和蛋白Ａ的单体ＩｇＧ抗体可通过该过程回收。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质纯化领域。更具体地，本专利技术涉及将疏水相互作用层析(HIC)用于分离免疫球蛋白G单体，以及在一种联合层析方法中联用HIC以进行IgG抗体分子的纯化。
技术介绍
历史上，蛋白纯化方案基于待纯化的蛋白质与不期望的蛋白污染物之间分子的大小，电荷和溶解度性质的差异。基于这些参数的方法包括分子排阻层析、离子交换层析和差速沉淀等。分子排阻层析，或被称为凝胶过滤或凝胶渗透层析，基于流动相中大分子穿入固定相颗粒的孔中。差速穿入是颗粒流体体积的作用。因此，在理想条件下，较大的分子从颗粒内部逐出而较小的分子可进入此体积，洗脱顺序可通过蛋白大小预测，因为在洗脱体积和分子量对数之间存在线性关系。层析支持物基于交联葡聚糖如SEPHADEX，球形琼脂糖珠和SEPHAROSE(可从瑞典的Pharmacia AB.Uppsala购得)，基于交联的聚丙烯酰胺如BIO-GEL(从BioRad Laboratories，Richmond，Caiifornia购得)或基于乙烯二醇-异丁烯酸共聚物如TOYOPEARLHW65(从Toso Haas Co.，Tokyo，Japan商品购得)在本专利技术某些方面的实施中，用于形成分子排阻或HIC层析的各种层析柱。沉淀法基于这样一个事实，即蛋白质粗混合物中，蛋白质各自的溶解度常常有较大不同。虽然在水溶性介质中，蛋白质的溶解度依赖于多种因素，但是就这种讨论而言，一般说来，如果一种蛋白质与溶剂的相互作用比与它相同或相似的蛋白质分子的相互作用强，则该蛋白质是可溶的。未想与描述沉淀现象的特殊作用机制理论结合，然而相信蛋白质与水分子之间的相互作用可通过氢键产生，借助于几种不带电基团和/或静电的，如偶极子，带电基团及沉淀剂如单价阳离子盐(如硫酸铵)与蛋白质竞争水分子。因而在高盐浓度下，蛋白质被“脱水”减小了与水环境的相互作用，增加了与相似蛋白质的聚集作用，导致从介质中沉淀。离子交换层析涉及样品中带电的功能基团与吸附剂表面相反电荷的离子功能基团的相互作用。已知两种普遍的相互作用。阴离子交换层析通过带负电的氨基酸侧链(如天冬氨酸和谷氨酸)与带正电的表面相互作用介导，阳离子交换层析以带正电的氨基酸残基(如赖氨酸和精氨酸)与带负电的表面相互作用介导。最近已发展亲合层析和疏水相互作用层析技术以补充较传统的大小排阻和离子交换层析方法。亲合层析依赖于蛋白质与一种固定化配基的特异性相互作用，该配基对感兴趣的具体的蛋白是专一的，该配基可以是底物、底物类似物、抑制剂、受体或抗体。或者该配基能与一些相关蛋白反应。可使用基团特异配基如磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或某些染料来回收一特定种类的蛋白质。考虑到抗体分子的纯化，可应用特异的或广泛的亲合技术。抗体亲合纯化的最专一配基选择是与目的抗体反应的抗原(或其抗原决定簇)。许多已知的免疫吸附剂试验如酶联免疫吸附试验(ELISA)便基于这种特异的抗原/抗体亲合反应。然而，广泛的亲合技术也有用。例如已知葡萄球菌蛋白A结合IgG类别的某些抗体(见Ey，P.L.et al.Immunochemistry 15429-36(1978))或者可用异源种类抗血清(如兔抗鼠抗血清)分离(见CurrentProtocols in Molecular Biology Supra，Chap 11)。疏水相互作用层析最早是观察到蛋白质可保留在含有烃间隔臂而缺乏亲合配基的亲合凝胶上之后发展起来的。虽然在此领域有时用术语疏水层析，但优选疏水相互作用层析，因为是疏水的溶质和凝胶之间的相互作用而非层析过程。在高离子强度下疏水相互作用最强，所以这种分离形式在盐沉淀或离子交换过程后便利地进行。从HIC支持物的洗脱受溶剂、pH、离子强度的变化或加入离液剂、有机调节剂如1，2亚乙基二醇或丙二醇的影响。疏水相互作用层析一般原理的叙述见美国专利3,917,527和4,000,098。应用HIC纯化特异蛋白参照下列公开内容举例说明人生长激素(美国专利4,332,717)，毒素偶联物(美国专利4,771,128)，抗溶血因子(美国专利4,743,680)，肿瘤坏死因子(美国专利4,894,439)，白介素-2(美国专利4,908,434)，人淋巴毒素(美国专利4,920,196)和溶菌酶类(Fausnaugh，J.L.and F.E.Regnier J.Chromatog.359131-146(1986))和可溶互补受体(美国专利5,252,216)。在一步法中，HIC和高效液相层析(HPLC)顺序使用从完整抗体分子中分离抗体片段(如F(ab’)2)(Morimoto，K.et al.，J.Biochem.Biophys.Meth.24107-117(1992))。除亲合和HIC技术外，一种或多种传统蛋白质纯化系统也已用于抗体纯化。例如，Hakalahti，L.等(J.Immunol.Meth.117131-136(1989))公开一种采用相继的两个离子交换层析步骤或者一种离子交换步骤接一个HIC步骤的方法。Danielsson A.等(J.Immunol.Methods 11579-88(1988))分别比较基于阴离子交换、阳离子交换、层析聚焦的一步法和HIC。虽然蛋白A亲合柱层析已被广泛使用，但也意识到从这种柱上洗脱抗体能导致从支持物上滤掉蛋白A残基。分子排阻HPLC(Das et al.，Analytical Biochem.14527-36(1985))和阴离子交换层析(EPO345549，published Dec.13，1989)被建议为处理这个问题的方法。现在令人惊奇地发现，HIC可用于从蛋白A层析支持物洗脱的IgG混合物中除去蛋白A污染。本专利技术涉及用HIC从含有同样物质的混合物中分离IgG单体，以及将HIC应用到结合蛋白A和离子交换层析的方法中，用于免疫球蛋白G分子的纯化。专利技术简述本专利技术涉及通过将所述混合物与疏水相互作用层析支持物接触，从支持物上选择性地洗脱单体从含有相同物质混合物的聚集物中分离IgG单体的方法。本专利技术的另一方面提供从含有同样物质的条件细胞培养基中纯化IgG抗体，包括顺序将培养基经过(a)蛋白A，(b)离子交换层析和(c)疏水相互作用层析。本专利技术的另一方面提供从包含蛋白A和抗体的混合物中除去蛋白A的方法，包括将所述混合物与疏水相互作用层析支持物接触，并从支持物上选择性洗脱抗体。附图详述附图说明图1说明根据本专利技术纯化抗体过程的流程图解。专利技术详述本专利技术涉及已用于大规模纯化免疫球蛋白分子的蛋白质纯化技术。该专利技术特别有用，因为它可回收＞95％蛋白纯度的IgG单体。本专利技术也可用于纯化一些不同的免疫球蛋白G分子。抗体样蛋白质为可通过在此描述的方法纯化的蛋白质，如果需要的话这种方法通过不必过度试验的常规、非专利技术调整进行改进。这些蛋白包括免疫球蛋白基因的同种型、同种异型和等位基因，截短形式，变化的抗体如嵌合抗体和人化抗体等，化学修饰的形式如被PEG处理，以及含有一种免疫球蛋白部分的融合蛋白。这些蛋白因为具有或保留足够的免疫球蛋白性质(如Fc决定簇)，可以通过本专利技术方法进行纯化，所以称为类抗体。除非特殊指明，否则术语抗体或免疫球蛋白也包括类抗体蛋白。本专利技术的免疫球蛋白分子可从一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从包含相同物质的混合物中纯化单体ＩｇＧ抗体的方法，包括将所述混合物与疏水相互作用层析支持物接触并从支持物上选择性地洗脱所述单体。２．根据权利要求１的方法，其中ＩｇＧ选自抗ＲＳＨＺ－１９和ＣＨ－ＣＤ４。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PJ谢德尔，JC艾利森，RG施科特，TM史密夫，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩比彻姆公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]