测量组分对细胞活性氧类物质产生的作用的方法技术

一种测定供试组分对细胞内ＲＯＳ水平的作用的方法。该方法可用于市场推广或筛选在降低细胞中ＲＯＳ水平方面有用的组分，细胞中ＲＯＳ水平受增加的ＲＯＳ产生不利影响。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测量组分对细胞活性氧类物质产生的作用的方法专利技术背景活性氧类物质(ROS)是由氧的代谢而形成的细胞副产物，是造成细胞氧化伤害的原因，并且可为细胞损伤、细胞功能失调和细胞死亡(细胞凋亡)的原因。已经充分证明ROS对细胞代谢的作用。ROS在组织中的聚集可引起氧化损伤，并且因此可能需要减少组织中ROS的量。需要监测细胞中的ROS产生以确定ROS是否涉及包括心血管、炎症和感染性疾病的疾病。正常情况下，细胞能够用酶，例如超氧化物岐化酶或过氧化氢酶预防ROS的氧化伤害。其它化合物，包括抗氧化剂，例如维生素、尿酸和谷胱甘肽在预防这样的伤害方面也是有用的。这样的化合物(如抗氧化剂)可在清除自由基和保护宿主有机体免受病原体侵害中起重要的作用。虽然已经开发了许多方法测量组织中的ROS的量，但是很少方法实时测量细胞内ROS浓度。测量ROS的量的能力是重要的，因为ROS浓度可随时间而变化，如增加或减少。因此，对于开发和给予有效的抗氧化剂组合物以预防ROS伤害存在持续的兴趣。然而，几乎没有方法能够实时测量组合物对ROS产生的作用。因此，需要开发可测量组分对细胞内ROS产生的作用的方法。专利技术简述依据某些实施方案，提供可用于实时测量细胞内ROS浓度的方法。此类实施方案的方法可用于测定供试组分对细胞内ROS产生和对细胞的氧化应激的作用。此类方法也可用于测定供试组分减少细胞内ROS组分的能力，其中ROS可为细胞内源性的或外源性的。因此，本文描述的某些实施方案包括测量供试组分对细胞中ROS的产生的作用的方法。该方法包括使细胞与能够发荧光的材料接触、使细胞与供试组分接触、使细胞与ROS或ROS刺激物接触和测量细胞荧光。此类实施方案还包括在使细胞与能够发荧光的材料以及ROS或者ROS刺激物接触后测量细胞荧光、在使细胞与供试组分接触后测量细胞荧光、比较两个荧光值和测定供试组分是否减少ROS。附图简述图1显示实施例1获得的荧光值；和图2显示如在实施例1中描述的各种供试组分的荧光值。专利技术详述如在本说明书中通篇使用的，范围用作描述在该范围内的各个值和每一个值的简略的表达方式。在范围内的任何值可选作该范围的终点。另外，本文所引用的所有参考文献通过引用而全文结合于本文中。如发生与在本公开以及本文所引用的参考文献中所定义的相冲突的情形时，以本公开的为准。除非另有说明，在本文和说明书的其它地方表达的所有的百分比和量应该被理解为是指重量百分比。给出的量基于材料的活性重量。贯穿本说明书中，冠词“该”、“一”、“一个”等的使用并不意欲将实施方案限制为该项的单数形式。例如，表达“一种组分”可表示单一组分或多个组分。实施方案中的组分包括化学化合物、小的和大的肽以及蛋白质、表达小的和大的肽以及蛋白质的DNA等。所述方法包括使细胞与当氧化或还原时能够发荧光的材料接触、使细胞与供试组分接触、使细胞与ROS或ROS刺激物接触和测量细胞荧光。优选，能够发荧光的材料是氧化时发荧光的染料，更优选是选自2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)、二氢罗丹明(DHR123)及其混合物的染料。所述方法也包括使用在还原时能够发荧光的材料。优选的方法包括使用抗氧化剂作为供试化合物。另一种优选的方法包括作为ROS的产生氧离子的化合物、产生自由基的化合物、过氧化物或其组合。优选ROS为过氧化物，更优选为过氧化氢。其它优选的方法包括使用ROS刺激物，例如炎性递质。优选的实施方案的方法还包括作为ROS刺激物的：(i)细菌内毒素、外毒素或其组合；或(ii)脂多糖、脂低聚糖或其组合。优选ROS为脂多糖。可用于优选的实施方案的多种方法中的细胞包括免疫细胞、淋巴细胞、成淋巴细胞、巨噬细胞、有核细胞例如线粒体或其混合物。细胞可无限增殖化，或存在于组织培养物中。优选，细胞具有可被染料透过的细胞壁。另外，染料可聚集于细胞线粒体中。优选从细胞中洗涤任何过多的染料。在优选的实施方案的方法中，主动或者被动地将供试化合物转运至细胞中。优选，从细胞中洗涤任何过多的供试化合物。按类似的思路(vein)，优选主动地或者被动地使ROS或ROS刺激物(如炎性递质)转运进入细胞内，并且优选从细胞中洗涤任何过多的ROS或ROS刺激物。依据优选的实施方案的多个方面，最初使细胞与在氧化或还原时能够发荧光的材料，优选染料接触。可用于本专利技术实施方案中的染料包括在氧化或还原时发荧光的染料。优选，这样的染料在如通过ROS氧化或还原时发荧光。优选使用染料，所述染料以不发荧光的形式与细胞接触，然后在与ROS，如产生自细胞内或者由外部来源引入的ROS反应时发荧光。具有这些属性的一些有用的染料为本领域中的普通技术人员所已知，并且可包括荧光素类型的染料，例如2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)。DCF-DA是能透过膜的染料，其可扩散穿越细胞脂质膜。其在无活性时不发荧光，而在被ROS氧化时形成高度发荧光的二氯荧光素(DCF)。可用于本专利技术中的其它染料可包括荧光素衍生物和类似物，例如为DCF-DA的类似物的二氢罗丹明(DHR123)。DHR123聚集在线粒体中，并且因此可在线粒体中具体用于测定ROS水平。其它有用的染料可包括荧光素的衍生物，例如OregonGreen、TokyoGreen、羧基半萘并荧光素(SNAFL-可从MolecularProbes，(InvitrogenCorp.)，Carlsbad，CA获得)、羧基萘并荧光素、AlexaFluor染料(如Alexa488一也可从MolecularProbes，(InvitrogenCorp.)，Carlsbad，CA获得)、DyLightFluor染料(如DyLight488，可从ThermoFisherScientific，Waltham，MA购得)和HiLyteFluor染料(可从AnaSpec，SanJose，CA购得)。可将细胞与染料一起孵育，以使染料结合至细胞中。然后，可洗涤细胞以去除残余的染料。在用染料标记后，可将细胞暴露于一种或多种供试化合物。这样的供试化合物优选通过主动或被动转运，如扩散导入细胞，并且优选留在细胞内。可在这样的供试化合物的存在下孵育细胞，然后洗涤以去除残余的供试化合物。在用供试化合物处理后，然后优选将细胞暴露于ROS。ROS典型地包括氧离子、自由基和过氧化物(无机和有机过氧化物两者)，和在细胞内产生这样的氧离子和自由基的化合物。ROS(或ROS试剂)为本领域中的普通技术人员所已知，一般为高度反应性的小分子，因为它们存在未成对价电子层电子。过氧化物的实例包括氢过氧化物、过氧化氢、碱金属和碱土金属的过氧化物、有机过氧化合物、过氧酸及其混合物。可将细胞暴露于来自外部来源的ROS试剂，其中可在含ROS试剂的培养基中孵育细胞，以在细胞内，如通过主动转运或者被动转运，使细胞与ROS试剂结合。然后可洗涤细胞，以去除尚未结合至细胞的残余的ROS。在本专利技术的一个实施方案中，可在诱导ROS产生的化合物，如ROS刺激物，例如炎性递质的联合下，使ROS与细胞接触，其中所述递质在细胞中引起或已知引起ROS产生。还在另一个实施方案中，在没有额外的ROS试剂存在下，使细胞与ROS刺激物接触。如本领域已知的，炎性递质可包括细菌毒素，如内毒素或外毒素，例如脂多糖或脂低聚糖。细胞可与R本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种测量供试组分在减少细胞中ＲＯＳ组分的效力的方法，所述方法包括：ａ．使细胞与能够发荧光的材料接触；ｂ．使细胞与供试组分接触；ｃ．使细胞与ＲＯＳ或ＲＯＳ刺激物接触；和ｄ．测量细胞荧光。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/0508712008年5月6日1.一种测量供试组分在减少细胞中ROS组分的效力的方法，所述方法包括：a.使细胞与能够发荧光的材料接触；b.使细胞与供试组分接触；c.从细胞中洗涤任何过多的供试组分；d.使细胞与ROS和ROS刺激物接触；和e.测量细胞荧光；其中所述ROS选自产生氧离子的化合物、产生自由基的化合物、过氧化物及其混合物；其中所述ROS刺激物选自细菌内毒素、外毒素及其混合物；以及其中所述供试组分转运至细胞内。2.权利要求1的方法，其中所述能够发荧光的材料是氧化时发荧光的染料。3.权利要求2的方法，其中所述染料选自2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)、二氢罗丹明(DHR123)及其混合物。4.权利要求1的方法，其中所述能够发荧光的材料是还原时发荧光的染料。5.权利要求1的方法，其中所述供试组分是抗氧化剂。6.权利要求1的方法，其中所述ROS是过氧化物。7.权利要求6的方法，其中所述过氧化物是过氧化氢。8.权利要求1的方法，其中所述ROS刺激物包括脂多糖。9.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·M·特里韦迪，
申请(专利权)人：高露洁棕榄公司，
类型：发明
国别省市：US