人分泌球蛋白的修饰和新型组合物制造技术

已经在体外通过化学修饰纯的蛋白质产生重组人CC10蛋白的新型组合物。已经通过利用活性氧物质和活性氮物质处理产生含有化学修饰rhCC10的亚型的几种新型合成制剂。这些制剂含有rhCC10已被表征与未修饰的蛋白质相比具有增强的或改变的生物学特性的新型亚型。含新颖亚型制剂可以用作标准，以确定和表征从血液或尿液天然CC10蛋白的天然存在的亚型，并最终以测量新型基于CC10的生物标记以评估患者疾病状态。这些制剂也可用于治疗呼吸、自身免疫性、炎症及用未修饰的蛋白质不能有效治疗的其他病症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的领域涉及化学或酶修饰的合成的分泌球蛋白制剂，与未修饰版本相比具有改变或增强的性能。更具体地，利用活性氧物质(ROS)、活性氮物质(RNS)、酶催化修饰的重组人分泌球蛋白蛋白质的修饰，如髓过氧化物酶加的过氧化氢，或转谷氨酰胺酶催化修饰。本专利技术进一步涉及的修饰分泌球蛋白的新亚型的特性，修饰分泌球蛋白的优化工艺，及分泌球蛋白亚型的隔分离。本文中的术语“亚型”是指包含一个或多个化学修饰的氨基酸的一种分泌球蛋白或CC10单体、二聚体、或其它包含长度为至少60个氨基酸的完整单体的多聚体复合物。本专利技术还涉及生物活性的改变，结构构象的变化，或通过它的一个或多个氨基酸化学或酶修饰的分泌球蛋白的生物化学特性。本专利技术还涉及通过用ROS、RNS、和酶催化的氨基酸修饰的化学修饰增强rhCC10的抗病毒活性。本专利技术还涉及通过用ROS、RNS、和酶催化的氨基酸修饰的化学修饰增强抑制中性粒细胞的迁移。专利技术背景分泌球蛋白是包括四螺旋束单体以形成二硫化物二聚体、四聚体和更高的多聚体结构上相关蛋白质的一族。有8个已知的人分泌球蛋白(图1)及克拉拉细胞(ClaraCell)10kDa蛋白(CC10)，也被称为子宫珠蛋白、克拉拉细胞16kDa蛋白(CC16)、克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)、子宫球蛋白、尿蛋白-1，及分泌球蛋白1A1(SCGB1A1)，是这一族中最丰富的和众所周知的成员。分泌球蛋白和CC10被认为在所有脊椎动物存在。虽然这些蛋白质生理作用和具体机制，包括CC10尚不清楚，但是认为基于所知的CC10、分泌球蛋白在调节免疫反应中起作用。哺乳动物分泌球蛋白的主要来源是肺和气管上皮细胞，尤其是无纤毛支气管气道上皮细胞(主要是克拉拉细胞)，及他们在成人肺的细胞外液中是非常丰富的局部产生的蛋白质。它们也在鼻腔上皮细胞中分泌。在血清和尿液中也存在呼吸分泌球蛋白，其在很大程度上是来自于肺源。CC10也由生殖组织(子宫、精囊)、外分泌腺(前列腺、乳腺、胰腺)、内分泌腺(甲状腺、垂体、肾上腺和卵巢)以及由胸腺和脾脏产生(Mukherjee,1999；Mukherjee,2007)。人CC10体内的主要是同型二聚体，由两个相同的70个氨基酸的单体组成，具有4.7-4.8的等电点。虽然它在SDSPAGE上以约10kDa的表观分子量迁移，但是其分子量为15.8kDa。单体以反向平行构型排列，具有与其它C-末端相邻的N-末端，及以完全氧化形式的二聚体，在Cys3单体和其它Cys69之间通过两个二硫键连接(Mukherjee,1999)。修饰蛋白质上的氨基酸残在有许多化学和酶促方法。所述分泌球蛋白经受N-末端信号肽的裂解，这是在哺乳动物细胞中分泌过程的一个组成部分。但是不知道他们是被糖基化还是脂质化。然而，在炎症反应期间分泌球蛋白通过相同的过程在细胞外环境中影响所有其他蛋白质。天然CC10在体内进行化学修饰及在患者样本中已经确定的天然CC10的新亚型在来自正常人的样本中不存在(Lindhal,1999；Ramsay,2001；Ariaz-Martinez,2012)。假定修饰是由炎症过程导致的，因为新亚型只在来自患有特征在于持续的或急性炎症的呼吸病症患者的气道内膜液(ALF)的样本中被确定。尽管有些人推测，修饰CC10是与由炎症反应所产生的活性氧物质反应的结果，但是修饰的性质目前是未知的。此外，氧化修饰天然CC10被认为代表损坏蛋白质，其抗炎活性和免疫调节功能受损，从而促进患有呼吸窘迫的早产儿慢性肺病的发展(Ramsay,2001)。合成CC10蛋白可通过重组或化学合成方法进行(Barnes,1996；Mantile,1993；Nicolas,2005)。CC10是结构相关的蛋白质统称分泌球蛋白的族中最知名的一个成员(Klug,2000)。八种人分泌球蛋白成熟分泌序列的氨基酸序列如图1中所示。N-末端是基于共识的信号肽切割位点的预测，并没有通过天然蛋白质的N-末端测序确认。所有分泌球蛋白共享一个保守的四螺旋束的二级结构，因此，一般认为介导相似的生理功能。生成活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)为与衰老和疾病相关的慢性炎症过程的一部分，或作为严重的炎症反应的结果，以对抗感染和其他急性损伤，如烟雾吸入。常见体内介导蛋白质氧化的ROS和RNS的化学试剂包括过氧化氢(H202)、Fe2+、Cu1+、谷胱甘肽、HOCl、HOCBr、1O2、和ONOO-，ROS和RNS可以作为酶的活性的结果在体内合成或释放，如髓过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、和P-450酶、和活化吞噬细胞的活性氧迸发的结果。脂质过氧化物如4-羟基-2-反式-壬烯醛(HNE)、(MDA)和丙烯醛是ROS和RNS的与脂质反应的产物，反过来，高反应性并能与蛋白质形成加合物。臭氧和紫外线，以及在O2和线粒体电子传递链泄漏存在下的γ照射，也引起蛋白质氧化。ROS和RNS的是不加区别化学反应剂，破坏的基本生物组分，包括核酸、脂质(包括膜和表面活性剂的磷脂)、和蛋白，在病原体和宿主二者中，往往造成明显的组织损伤比原来的感染或炎症反应的其他原因可能更危及生命。例如，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)通常是由急性肺部感染(肺炎)引发，其导致ROS和RNS的释放，并且因肺组织损伤包括肺功能损害通常具有40-60％的死亡率，甚至在病原体引起的感染使用抗菌药物被控制之后还是一样。有几种类型的氧化蛋白质修饰，其中最常见的是硫氧化，在其中在半胱氨酸(Cys)，S-巯基化，和甲硫氨酸(Met)亚砜之间的二硫键中形成。蛋白质的羰基也是常见的氧化修饰，其中氨基酸侧链被转化成醛和酮，特别是赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)。脂肪族氨基酸可被转化为它们的羟基(过氧)衍生物。可能会出现氯胺和脱氨基化合物。某些氨基酸可被转化成其它氨基酸，如组氨酸(His)与天冬酰胺(ASN)，而其他的可能形成的脂质过氧化加成物、氨基酸氧化加成物(例如p-羟基苯乙醛)、和糖基化加成物(例如羧甲基赖氨酸)。在宏观蛋白质水平，暴露于ROS和RNS可能会出现交联、聚合和肽键裂解的结果。有12种氨基酸通过ROS和RNS被在体内修饰成几个生理氧化产物，如表1中所示。在一般情况下，氨基酸半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)是最易被氧化的，不像其他氨基酸氧化，Met和Cys的氧化是可逆的(甲硫氨酸亚砜还原酶和谷胱甘肽和硫氧化还原蛋白氧化还原系统)(Stadtman,2002)。表1：ROS和RNS引起的氨基酸修饰修饰分泌球蛋白也可酶促介导的，而不是仅仅由通过酶例如MPO产生的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，包括化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白，具有一个或多个修饰的氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 13/843，7731.一种组合物，包括化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白，具有一个或多个修饰的氨基
酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其中化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一个或多
个甲硫氨酸亚砜。
3.如权利要求1所述的组合物，其中化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一个或多
个硝基酪氨酸、氯代酪氨酸、或二酪氨酸。
4.如权利要求1所述的组合物，其中化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一个或多
个谷胱甘肽半胱氨酸或HNE-半胱氨酸。
5.如权利要求1所述的组合物，其中化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一个或多
个羰基。
6.如权利要求1所述的组合物，其中化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一个或多
个羟基脯氨酸或吡咯烷酮。
7.如权利要求1所述的组合物，其中化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一个或多
个α-氨基己二酸半醛、氯胺、MDA-赖氨酸、HNE-赖氨酸、丙烯醛-赖氨酸、羧甲基赖氨酸、或
PHA-赖氨酸。
8.如权利要求1所述的组合物，其中化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一个或多
个2-氨基-3-酮丁酸、氯胺、羟基色氨酸、硝基色氨酸、犬尿氨酸、缬氨酸或亮氨酸过氧化物、
草酸或丙酮酸、羟基苯丙氨酸2-氧代组氨酸或HNE-His。
9.如权利要求1所述的组合物，其中化学或酶促氧化合成的分泌球蛋白具有一个或多
个标记、化合物、脂质、或肽类连接到谷氨酰胺或...

【专利技术属性】
技术研发人员：爱普瑞·L·皮隆，哈姆恰·K·哈里普拉卡什，理查德·S·克莱顿，梅莉莎·E·温，
申请(专利权)人：希拉布朗治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US